甘蓝型油菜硼转运子基因的克隆 表达和分子进化.docx

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书学位沦文 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位沦文 刁 如需保密，解密时间 年 月 日 是否保密 侈 独创性声明 本人声明所星交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致i射的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行7审定。与我一NT作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生始≯焱鲁 帆训，年6月2；日 撇：泌彳靳躲一 签名日期：2。11年5 FJ二；日 签名日期：弘11年6月2弓日 甘蓝型油菜硼转运子基因的克隆、表达和分子进化日习℃ 甘蓝型油菜硼转运子基因的克隆、表达和分子进化 日习℃ 摘要 I ABSTRACT ．III 缩略语表 ．VI AbbreviatiOil ．VI 1前言 ．1 1．1引言 1 1．2文献综述 1 1．2．1土壤和植物中的硼 。2 1．2．1．1土壤中硼的分布和分类 2 1．2．1．2我国土壤中硼的现状 2 1．2．1．3硼在植物中的分布 3 1．2．2硼在植物中的生理功能 一3 1．2．2．1硼与细胞壁 4 1．2．2．2硼与细胞膜 5 1．2．2．3硼与碳水化合物 5 1．2．2．4硼与激素 6 1．2．2．5硼与酚类 ．6 1．2．2．6硼与生殖发育 7 1．2．3硼在植物体中的转运 7 1．2．3．1硼的被动吸收 7 1．2．3．2硼与糖的共运输 ．8 1．2-3．3水通道介导的硼转运 9 1．2．3．3转运子介导的硼转运 ．．10 1．2．4植物硼营养高效的研究 12 1．2．4．1植物硼营养效率的基因型差异 ．．12 1．2．4．2植物硼营养高效的机制 12 1．2．4．3甘蓝型油菜硼高效的研究 。13 2本研究的目的和意义 一15 2．1研究意义 ．．1 5 2．2研究内容 1 5 2．3研究目标 ．．1 6 2．4技术路线 。16 3硼高、低效品种的性状考察 17 3．1材料与方法 ．17 3．1．1植物材料和培养方法 17 3．1．2营养液培养试验的设计 17 3．1．3生理指标和硼浓度的测定方法 18 3．1．4数据处理和统计分析 1 8 3．2结果与分析 ．．18 3．2．1硼对甘蓝型油菜硼高、低效品种干重和根长的影响 18 3．2．2不同硼水平下，甘蓝型油菜硼高、低效硼累积和转运能力的差异 21 3．3讨论 ．23 4甘蓝型油菜BnBORl基因的克隆和分子进化 24 华中农业大学2011届博士研究生学位论文4．1材料和试剂 华中农业大学2011届博士研究生学位论文 4．1材料和试剂 24 4．1．1植物材料 ．24 4．1．2菌株 ．24 4．1．3试剂和试剂盒 ．24 4．1．3．1核酸提取以及检测试剂 24 4．1．3．2基因克隆试剂及试剂盒 25 4．1．3．3 Southern杂交试剂及试剂盒 26 4．2实验方法和步骤 27 4．2．1植物材料的处理 ．27 4．2．2核酸的提取 ．27 4．2．2．1基因组DNA的提取 27 4．2．2．2基因克隆的总RNA的提取 28 4．2．2．3总RNA中DNA的去除 29 4．2．2．4 DNA和RNA浓度的测定和质量检验 29 4．2．3基因克隆 。31 4．2．3．1逆转录RACE第一链eDNA合成 ．．3l 4．2．3．2 5’一和Y-RACE ．．32 4．2．3．3甘蓝型油菜BOR基因全长的分离 ．34 4．2．3．4 BnBORl．1a上游序列的分离 ．．35 4．2．3．5甘蓝型油菜BOR基因PCR产物的连接转化和测序 37 4．2．4分子进化分析 ．41 4．2．4．1甘蓝型油菜BOR家族的Southern杂交分析 41 4．2．4．2核酸和蛋白质序列结构和功能的生物信息学分析 45 4．3结果与分析 ．50 4．3．1总DNA和RNA的提取 50 4．3．2甘蓝型油菜硼转运子基因的克隆 ．51 4．3．2．1 RNA逆转录成eDNA 51 4．3．2．2甘蓝型油菜BOR基因3’一和5-RACE末端克隆 51 4．3．2．3甘蓝型油菜BOR基因全长eDNA和基因组序列的克隆 53 4．3．2．4砌BDRJ『jJ『口上游序列的克隆 一54 4．3．3分子进化分析 55 4．3．3．1 Southern杂交鉴定甘蓝型油菜BOR基因数目 ．55 4．3．3．2芸薹族BORl基因核酸序列的特点 57 4．3．3．3 BnBORl基因蛋白质序列的分析 60 4．3．3．4芸薹族BORl基因的分子进化特征 69 4．4讨论 ．．77 4．4．1基因家族成员的一些结构特征 ．