甘蓝型油菜pol CMS恢复基因调控因子的筛选和温敏基因的GWAS分析.docxVIP

华中农业大学2016届硕士研究生学位(毕业)论文2．3．3转化农杆菌 华中农业大学2016届硕士研究生学位(毕业)论文 2．3．3转化农杆菌 ．．1 5 2．4拟南芥遗传转化 ．16 2．5转基因拟南芥GUS染色 16 2．6花药半薄切片制作 ．1 7 2．7酵母文库构建 ．1 7 2．8酵母转化步骤 ．19 2．9关联分析 ．20 3结果与分析 22 3．1 RZo启动子生物信息学分析 22 3．2 GUS染色分析 ．23 3．3酵母单杂交 ．25 3．3．1诱饵质粒转化酵母菌Y1HGold ．25 3．3．2总RNA完整性检测 26 3．3．3 cDNA的合成，扩增和纯化 26 3．3．4转化子的获得 ．．27 3．4群体构建 ．28 3．5群体育性的调查 ．29 3．5全基因组关联分析 ．31 4讨{仑 ．．34 4．1聊基因启动子功能性分析 34 4．2温敏基因对pol TCMS育性变化的影响 ．．35 参考文献 37 附录 ．．45 致谢 ．．47 Ⅱ 万方数据 甘蓝型油菜polCMS恢复基因调控因子的筛选和温敏基因的GWAS分析摘要 甘蓝型油菜polCMS恢复基因调控因子的筛选和温敏基因的GWAS分析 摘要 波里马细胞质雄性不育(pol CMS)被称为“第一个有实用价值的油菜雄性不育 类型”，目前我国利用三系配套育成的杂交品种60％来自于pol CMS。温敏型的pol TCMS在低温下部分恢复育性，高温下稳定不育还可以实现两系制种。为了解析恢 复基因的调控机制和pol TCMS温度敏感的分子机理，使pol CMS系统更好的应用 于油菜杂种优势，本研究用酵母单杂交的方法筛选了恢复基因Rfp的调控因子，用 全基因组关联分析的方法对温敏基因初定位，主要研究成果如下： 1．对助基因上游600 bp的启动子序列进行顺式作用元件分析，结果表明该段 启动子序列含有CAAT box和TATAbox、光调控元件、激素响应元件等顺式作用元 件。构建5个尺廖启动子5’端截短载体，转化拟南芥发现ATG上游151 bp就能驱 动GUS基因在花蕾中的表达，而ATG上游118 bp不能驱动GUS基因的表达，根 据实验结果我们确定Rfp基因的启动子核心顺式作用元件在ATG上游151 bp内。我 们用甘蓝型油菜恢复系的幼蕾(O．5一lmm)构建了cDNA文库，用ATG上游394 bp构 建酵母诱饵载体进行筛选，通过点对点验证获得一个与诱饵片段结合的蛋白，经过 生物信息学分析发现该基因可能参与生物学胁迫响应和细胞间信号传导的功能。 2．从530份甘蓝型油菜自然群体中挑选出86份保持系与6330A做杂交构建F1 群体，将杂交群体秋播于武汉，通过观察群体的表型发现：在3月初开花时温度较 低(低于16。C)，不同材料之间呈现不同的育性等级；4月初温度升高，群体全部呈 现不育表型，说明群体中可能存在一种和温度响应相关的调控因子。利用89份甘蓝 型油菜自交系的60K SNP芯片信息，用Q模型进行全基因组关联分析，共检测到在 A9、A5、A2、A8染色体上有多个标记位点可能与温敏基因相关。 关键词：雄性不育；启动子；酵母单杂交；温敏基因；关联分析 万方数据 华中农业大学2016届硕士研究生学位(毕业)论文Abstract 华中农业大学2016届硕士研究生学位(毕业)论文 Abstract pol cytoplasmic male sterility(CMS)system is considered as‘the first CMS system of rapeseed with practical value’，about 60％seed production was used in China for commercial hybrid；pol TCMS is sterile at high temperatures and partially fertile at low temperatures，It also Can support two lines．In order to fully understand the regulation mechanism of restore gene and temperature sensitive genes in pol TCMS，make more extensive use of heterosis，In this research we screening regulatory factors about Rfp by yeast one—hybrid，using genome—wide association analysis method to early positioning fo