实验十-体外扩增DNA及扩增产物鉴定.ppt

五、注意事项 PCR非常灵敏, 操作应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。 吸头、离心管应高压灭菌, 每次吸头用毕应更换, 不要互相污染试剂。 加试剂前, 应短促离心10秒钟, 然后再打开管盖, 以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。 PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。 应设含除模板DNA所有其它成分的负对照。 问题与讨论 降低或提高退火温度对PCR反应是否有影响？为什么？ 延长加热变性时间对PCR反应有何影响？ PCR反应有哪些主要应用？试通过查阅资料举例说明。 酶切反应中，“星号活性”代表什么意思？如何避免产生“星号活性”？ 如何根据待分离DNA 的大小选择合适的琼脂糖凝胶浓度？ DNA Marker (ladder) 　 * Most researchers are well versed in the performance of PCR. However, I usually emphasize that the performance of Real-Time PCR requires an emphasis on each step. STEPS 1) Prepare the Master Mixture and add all components to the reaction tube. 2) Denature the Template to generate single-stranded DNA. Usually performed at 95 oC for 30 to 60 s. 3) Annealing temperature. The temperature is lowered in order to promote the binding of the primers to its complimentary target. Generally ranges between 50 and 65 oC. * Starts with a Picture of the Annealed Template. 4) Extension Step - Between 65 and 72 oC. In many cases, this step is linked to the annealing temperature. When done this way, it is considered a 2 step PCR. Lead into next slide It is repeated to generate an exponential growth. * This demonstrates the power of exponential growth. Start with 2 copies, then 4 copies, then 8 copies, etc. White Clover 聚合酶链式反应（PCR）及酶切鉴定转化产物 一、实验目的 二、实验原理 三、实验试剂 四、实验步骤 五、注意事项 讲授内容  学习和掌握PCR的基本原理和实验技术 学习和掌握限制性内切酶双酶切鉴定转化产物的基本原理和实验技术 掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理和实验技术 一、实验目的  聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种通过体外酶促反应大量、快速、选择性地合成目的DNA片段的核酸合成技术。 具有高度特异性、操作简单、高效快速、灵敏度高等特点，是最常用的分子生物学技术之一。 二、实验原理 PCR的基本原理 试管中进行的DNA复制反应，依据 DNA半保留复制的机理； 体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性质； 通过人为控制体外合成系统的温度，使 双链DNA变成单链， 单链DNA与人工合成的引物退火， DNA聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。 PCR原理 5’ 5’ 3’ 3’ d.NTPs 耐热DNA聚合酶 引物 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 添加反应混合液 及样本 变性 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 退火 加入试管中 延伸 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 继续延伸 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ Taq Taq 3’ 5’ 3’ Taq Taq 5’ 5’ 循环 PCR原理 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 第二个循环 4个拷贝 第三个循环 8个拷贝 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’