乳与乳制品微生物检验方法嗜冷菌的检测.doc

乳与乳制品微生物检验方法嗜冷菌的检测 YLNB 3.3 方法一：（仲裁法） 1、引用依据：IDF标准101A：1991——乳中嗜冷菌的检验，6.5℃，培养10天 2、范围 此方法用于原奶和巴氏杀菌奶的检验。 3、试剂与培养基 3.1 生理盐水； 3.2 培养基：平板计数琼脂23.5g+脱脂奶粉1g,溶于100ml蒸馏水中。必要时用滤纸过滤。调节pH值为6.9±0.1℃。将培养基分装倒入三角瓶中，每瓶100-150ml。在121±1℃下灭菌15min，如果培养基马上要用，用水浴锅冷却到46±1℃。如果不是，则为了不耽误培养基的使用，在实验开始前，将培养基放入沸腾水浴中使其完全熔化，然后再放入水浴中冷却到46±1℃。 注：其中脱脂粉应该不含有抑菌剂。 4、仪器及器材 4.1 恒温培养箱：36±1℃； 4.2 冰箱：0-4℃； 4.3 恒温水浴锅：46±1℃； 4.4 天平； 4.5 均质器或乳钵； 4.6灭菌平皿：直径90mm； 4.7 灭菌试管：18×180和20×200； 4.8 灭菌吸管：1 ml和10 ml； 4.9 灭菌广口瓶或三角烧瓶：容量为500ml； 4.10 灭菌玻璃珠：直径约5mm； 4.11 酒精灯； 4.12 试管架； 4.13 灭菌刀、剪子、灭菌镊子等； 4.14 pH计。 5、方法 5.1样品的稀释及培养 5.1.1 以无菌操作，将25ml样品注入含有225ml灭菌生理盐水的三角瓶内，充分混匀，制成1：10的稀释液。 5.1.2 用1ml灭菌吸管吸取1：10的稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水的试管内，充分混匀，制成1：100的稀释液。 5.1.3 另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序，作10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用1支吸管。 5.1.4 根据对样品污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。 注：其他稀释方法可以使用，例如第一步稀释可以是10ml检测样品注入到90ml稀释液中，或11ml检测样品注入到99ml稀释液中。当样品和稀释液用量更大，方法的精密度和准确度就更高。 5.1.5稀释液移入平皿后，应及时将凉至46℃的培养基（可放置于46±1℃水浴保温）注入平皿约15ml，并转动平皿使混合均匀。同时将培养基倾入空的灭菌平皿内作空白对照。 注：从稀释样品到倾倒培养基，整个操作过程不应超过15min。 5.1.6 待培养基凝固，翻转平板，放入6.5℃培养箱内培养10天。 注：每叠皿不应超过6个，每叠皿之间以及与培养箱的壁之间应保持一定的间隙。 5.2 菌落计数方法 对平皿进行菌落计数时，应在柔和的光线下计数。为了便于计数，可使用适当的放大镜和（或）菌落计数器。以防极小的菌落遗漏，以及避免将平皿中杂质颗粒进行计数。仔细检查可疑的物质，如需要可使用更高倍数的放大镜，以区别菌落和外来物质。 5.3 菌落计数的报告 5.3.1 平板菌落数的选择 平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而另一半菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。平板内若有链状菌落生长时（菌落之间无明显界限），若仅有一条链，可视为一个菌落；如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落计。 5.3.2 稀释度的选择及报告 5.3.2.1 选取菌落数在10-300之间的培养皿作为计数的测定标准。 5.3.2.2 若有两个稀释度，其生长的菌落数在10-300之间，则按下面的方法计数。 计算每ml牛奶中微生物的个数N，用以下的公式： N= 这里∑c： 是所有皿上菌落数的总和。 n1： 是第一个稀释度培养皿的个数。 n2： 是第二个稀释度培养皿的个数。 d： 是与第一个稀释液相对应的稀释因子 结果保留两位有效数字，后面的数字以四舍五入计算。当第三位数是5时，看其左边的数是奇偶数进行数字取舍；如28500进行数字取舍为28000，11500为12000。 结果以科学计数法表示。 举例 微生物计数给出以下的结果（包括两个带盖培养皿）： 在第一个稀释度（10-2）：168和215个菌落 在第二个稀释度（10-3）：14和25个菌落 根据上面所说结果进行取舍为19000，结果为1.9×104个/ml。 注：如果有两个以上可以计数的稀释度，公式应修改为用多个稀释度进行计算。如为三个稀释度，由下面的公式可计算出每毫升中微生物的数量。 5.3.2.3 如果菌落数均小于10，则按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数，报告每毫升牛奶菌落的估计数。 5.3.2.4 如果菌落数均超过300，则按稀释度最高的平均菌