乳与乳制品微生物检验方法双歧杆菌的检验.doc

乳与乳制品微生物检验方法双歧杆菌的检验 YLNB 3.7 1、引用依据：GB/T4789.34-2003 2、术语和定义 双歧杆菌：一群能分解葡萄糖，产生大量乙酸和乳酸，厌氧，不耐酸，不形成芽孢，不运动，细胞呈现多样形态的革兰氏阳性杆菌。 3、 仪器及器材 3.1培养箱：36±1℃； 3.2 恒温水浴：46±1℃； 3.3显微镜； 3.4厌氧培养箱； 3.5离心机； 3.6 天平； 3.7电炉； 3.8吸管； 3.9 广口瓶或三角瓶：容量为500ml； 3.10 平皿：直径约90mm； 3.11 试管； 3.12 酒精灯； 3.13 灭菌刀或剪子； 3.14 灭菌镊子。 4、培养基和试剂 4.1 生理盐水； 4.2 75%乙醇溶液； 4.3 TPY琼脂培养基； 4.4 BL琼脂培养基； 4.5 BBL 琼脂培养基； 4.6双歧杆菌生化用基础培养基 ； 4.7 PYG液体培养基； 4.8革兰氏染色液； 4.9灭菌液体石蜡。 5. 检验程序 测定乙酸、乳酸 测定乙酸、乳酸 生化培养观察10天 接受PYG厌氧培养 分纯 厌氧培养 选择2—3个适当稀释度，各取0.1mL分别涂布于BL,BBL,TPY培养基 25g（mL）检样样 加225mL灭菌生理盐水，做成几个适当倍数的稀释液 菌中鉴定报告 菌落计数报告 革兰氏染色，过氧化氢酶试验 36±1℃ 72h±3h 37℃ 72 h 6、方法 6.1以无菌操作将充分混匀的检样25g（ml）放入含有225ml灭菌生理盐水的灭菌锥形瓶内做成1：10的均匀稀释液。 6.2 用1 ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1 ml，沿管壁徐徐注入含有9 ml灭菌生理盐水的试管内，振摇混匀，作成1：100的稀释液。 6.3 另取1 ml灭菌吸管，按上述操作顺序，作10倍递增稀释液，如此每递增一次，即换用1支1ml灭菌吸管。 6.4选取2个～3个以上适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，各取0.1ml分别加入计数培养基平皿，均匀涂布，每个稀释度作两个平皿。最好同时选用2种～3种培养基（BL、BBL、TPY培养基），同时作灭菌生理盐水空白对照。 6.5待琼脂表面干后，翻转平皿，放置厌氧罐内，操作全过程须在20min内完成。 6.6将厌氧罐置36℃±1℃温箱内培养培养72h±3h，观察双歧杆菌菌落特征见表1。选择菌落数在30～300之间的平板对可疑菌落进行计数，随机挑取五个可疑菌落进行革兰氏染色，显微镜检查和过氧化氢酶试验。过氧化氢酶阴性，革兰氏染色阳性，无芽孢，着色不均匀，出现“Y”或“V”型的分叉状、或棒状等多形态的杆菌可定为双歧杆菌。 表1 双歧杆菌在不同培养基上菌落生化形态特征 培养基 双歧杆菌特征 BL培养基为黄色 菌落中等大小，表面光亮，边缘整齐呈瓷白色、奶油色，质地柔软、细腻 BBL培养基为黄色 菌落中等大小，表面光滑、凸起，边缘整齐呈奶油色，质地柔软、细腻 TPY培养基为黄色 菌落表面光滑，凸起，边缘整齐呈奶油色、瓷白色，质地柔软、细腻 6.7菌落计数：根据证实为双歧杆菌的菌落数，计算出平皿内的双歧杆菌数，然后乘以样品的稀释倍数，得每毫升样品中双歧杆菌数。取三种培养基中计数最高的为最终结果。例如，检样1×104 倍的稀释液在BBL琼脂平板上，生成的可疑菌落为35个，取5个鉴定，证实为双歧杆菌的是4个，则1ml样品中双歧杆菌数为： 10 ×35×4/5×104 =2.8×106 7、双歧杆菌菌种鉴定 具体操作请参照对应的生化鉴定试剂盒的说明书。