总RNA提取定量与RT-PCR__20111226.pptVIP

操作步骤 采用TaKaRa PrimeScript RT reagent kit进行cDNA第一链合成： 按下列组分配制RT反应液 5X PrimeScrip Buffer 2.0μl PrimeScript RT Enzyme Mix 0.5 μl Oligo dT Primer (50 μ M) 0.5 μl Random 6mers (100 μ M) 0.5 μl Total RNA 6.5 μl 总体积 10?l 反转录反应条件如下 37℃ 15min （反转录反应） 85℃ 5sec （反转录酶失活反应） 注：反转录步骤在PCR仪中进行 Random 6 mers为随机的6核苷酸引物，引物序列为5-(P)NNNNNN-3，其5端和3端均含有-OH，因此可往两端延伸，特点是产物量大，特异性差，适用于长的或具有Hairpin构造的RNA。包括rRNA、mRNA、tRNA等在内的所有RNA的反转录反应都可使用本引物。 Oligo dT Primer适用于具有Poly（A）Tail的RNA，因而特异性好，但因其只结合Poly A尾巴，对于较长的mRNA，经常不能延伸到5端。（原核生物的RNA、真核生物的rRNA、tRNA以及某些种类真核生物的mRNA等不具有Poly（A）Tail）。 第一链cDNA 2?l PerfectShot Taq 10?l 上游引物 (10?M) 1?l 下游引物 (10?M) 1?l RNase Free H2O 总体积 6?l 20?l 取0.2 ml PCR反应管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂(注意每换一种试剂换一个新吸头)： 如配好的反应液较多沾到管壁上，可将PCR反应管置台式离心机中瞬时离心，使反应液集中于管底，然后将反应管放到基因扩增仪(PCR仪)上 . PCR反应体系 ① 94℃预变性5分钟后开始以下循环 ② 94℃ 30 秒 55℃ 30 秒 30 循环 72℃ 30 秒 ③ 72℃ 5 分钟 ④ 4 ℃ 保温 实验过程约1小时30分钟 PCR参数设置 PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94℃变性30s， 60℃退火30s， 72 ℃延伸45s。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。 温度（℃） 时间（min） 94 72 60 94℃变性（30s） 55 ℃退火（30s） 72 ℃延伸（30s） 循环1 循环2 循环3 PCR反应的温度循环周期 本实验所扩增的产物DNA片段长度400bp～500bp, 可取5?l PCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。利用标准DNA marker评估扩增的特异性。 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度 DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动. DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系). 琼脂糖凝胶电泳原理 影响迁移速率因素 1、 DNA的分子大小 2、 琼脂糖浓度 3、 DNA分子的构象 4、 电源电压 5、 嵌入染料的存在 6、 离子强度影响 琼脂糖凝胶电泳原理 有效分离范围 实验材料 电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝呈蓝紫色；二甲苯晴呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。 染料：Gelview、EB 电泳缓冲液：TBE 琼脂糖 DNA Marker 5000 溴化乙锭(EB) :3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐)，可与DNA结合,在紫外光照射下呈现红橙荧光,有致癌性. Gelview: 是一种新型核酸染料,可与DNA分子形成复合物，能产生极强的荧光信号，其灵敏度比EB高, 且荧光强度与DNA含量成正比荧光,在紫外光照射下呈现绿色荧光. 常用染料 实验材料 含有分子量不同的DNA片段，主要用途就是DNA分子凝胶电