GM试验标准操作规程.doc

GM试验标准操作规程 1．目的 规范GM试验标准操作规程。 2.操作授权人 经过培训并通过考核的微生物实验室工作人员。 3.用途： 采用酶联免疫双抗体夹心一步法（ELISA）半定量检测人血清标本中半乳甘露聚糖抗原。 4．原理 采用双抗体夹心ELISA方法检测血清样本中半乳甘露聚糖抗原。微板中包被半乳甘露聚糖抗体，可与样本中半乳甘露聚糖抗原和试剂中酶标抗体试剂结合形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，然后加入TMB底物产生显色反应。通过酶标仪检测吸光度（OD值），经公式计算得到I值，根据I值与cut-off值（0.5）的比较判断有无曲霉菌的感染或感染的程度。 5．样本要求 5.1标本类型：血清 5.2标本采集和储存：见试剂说明书 5.3标本处理: 标本编号后离心3000r/min，10min当日不做的标本离心后及时放入2-8℃冰箱冷藏，详见试剂说明书。 6．操作步骤： 6.1试剂从冰箱取出平衡30分钟，恢复至室温状态方可使用, 提前40分钟将水浴箱调成100℃。6.2配洗液：将R2浓缩清洗液用蒸馏水以1：20稀释，备用。 6.3样本/对照质控的处理：300ul质控血清/病人样本+100ul样本处理液R7（专用无热源离心管和枪头）混合振荡后进行水浴100℃ 3min，然后10000g离心10min,取上清液待用。 6.4从微孔板取出微板架盒微孔条R1,将不准备使用的反应条返回袋中，连同干燥剂一起，封入袋中。每孔加50ul酶结合物R6,再依次每孔加入50ul已处理质控血清/病人标本的上清液。密封膜封好，在37℃±1℃温度下孵育90±5min。 6.5洗板：5次，每孔加满但不可溢出，间隔2-3S倒掉，最后一次拍干。 6.6每孔快速加入200ulTMB溶液R9且避光。 6.7微板室温（18-25℃）避光孵育30±5min。 6.8终止反应：加入100ul终止液R10，并小心擦干微板底部。 6.9读数：加入终止液30min之内，在450/620nm处读取OD值。并计算I值 7.结果判断 结果解释：阳性结果 I值≥0.50 阴性结果 I值0.50 在受检标本中是否存在或缺失半乳甘露聚糖抗原,可通过每个病人样本的指数计算来断定。指数（I）是样本的光密度值除以含Cut-off对照血清的小孔光密度值均值得到的。 Cut-off对照光密度均值的计算 Cut-off对照血清R4两个小孔的光密度总和除以2。 每个受检血清指数I的计算 为每个受检血清计算下面的比率： I=[样本光密度/Cut-off对照光密度均值] 指数0.50的血清解释： 指数0.50的血清被认为是半乳甘露聚糖抗原阴性 注释：阴性结果表示病人的结果低于实验的可检测水平。 阴性结果不排除侵袭性曲霉菌感染的诊断。如果结果是阴性的，而怀疑感染了疾病，建议重新检测。 指数≥0.50的血清解释: 指数≥0.50的血清学被认为是半乳甘露聚糖抗原阳性 对于所有阳性病人,建议随后的检测,从同一样本中取新的一等份重新检测。 注释：吸光度低于0.000，可以表示实验步骤或设备出错，应当对错误进行评估。实验结果无效并且标本需要重做。 8.质量控制（有效性）： Cut-off对照液：每个cut-off对照液血清的光密度必须≥0.300且≤0.080 阳性对照：阳性对照血清指数必须大于1.50 I=[ 阳性对照光密度(R5)/Cut-off对照光密度均值 ] 1.50 阴性对照:阴性对照血清指数必须小于0.40 I=[ 阴性对照光密度(R3)/Cut-off对照光密度均值 ] 0.40 不符合上述有效标准的对照液,则所有分析无效,病人标本结果不能报告.重新审阅操作步骤后,再做分析;或咨询生产商,寻求帮助.(如果重新分析,在重做分析中应使用新的同一样本) 9.试剂： 9.1试剂名称：PlateliaTM 曲霉菌抗原检测试剂盒。 9.2、试剂生产厂家：美国伯乐公司 9.3、包装规格：96T/Kit 4、试剂盒组成：微孔板、浓缩清洗液、阴性对照血清、cut-off质控血清、阳性对照血清、酶标结合物、样本处理液、TMB溶液、终止液、微板密封板、说明书等。 10.注意事项： 用于对侵袭性曲霉菌感染高危患者的筛查诊断，动态疗监测及临床用药的评估。