沙门菌检查法.doc

沙门菌检查法 1 简述 沙门菌属是肠杆菌科的重要致病菌，按Bergey系统细菌学手册第一卷（1984），沙门菌分5个亚属。2003年出版的第八版的临床微生物手册将沙门菌属分成两个菌种即肠炎沙门菌和乍得沙门菌，其中肠炎沙门菌分6个亚种，包括常见的伤寒、甲型副伤寒、乙型副伤寒、丙型副伤寒、，鼠伤寒，猪霍乱等沙门菌杂内，迄今已发现2501个血清型。O抗原抗血清A-E群包含了沙门菌分离株的95%，所以常用沙门菌A-F O多价血清进行沙门菌初筛试验。药品中的沙门菌，是以鉴定沙门菌属为准，即对没10g（或10ml）药品中是否检出沙门菌作出检验报告。 由于沙门菌血清型繁多，各血清型的生化及血清学特性虽密切相关，却不尽相同，采用一种增菌培养基和两种分离培养基，不可能涵盖所有沙门菌的最适增菌及分离条件。 此外，由于药品在生产过程中，常受到加热、干燥等加工步骤的影响，药品中污染的沙门菌可受到损伤或呈休眠状态，故须在增菌培养前先进行预增菌。然后再进行增菌及分离、三糖铁琼脂初步鉴别、生化试验、血清学试验等步骤。 2 仪器、设备及用具（见大肠埃希菌2）。 3 试液指示液（参见大肠埃希菌3） 3.1 无菌脲试液[附录2.5]。 3.2 酚磺酞指示液[附录4.4]。 3.3 亮绿试液[附录2.9]。 3.4 氰化钾试液[附录2.14]。 3.5溴甲酚紫指示液[附录4.5]。 3.6 革兰染色液[附录2.4，2.10，2.16]。 3.7 沙门菌属A-F“O”多价血清（即O多价1）生物制品研究所供应。 4 培养基 4.1 营养琼脂培养基[附录5.2]。 4.2 营养肉汤培养基[附录5.1]。 4.3 半固体营养琼脂培养基[附录5.3]。 4.4 曙红亚甲蓝琼脂培养基（EMB）[附录5.8]。 4.5 麦康凯琼脂培养基（MacC）[附录5.9]。 4.6 四硫磺酸钠亮绿培养基（TTB）[附录5.11]。 4.7 三糖铁琼脂培养基（TSI）[附录5.10]。 4.8 胆盐硫乳琼脂培养基（DHL）[附录5.13]。 4.9 沙门菌属志贺菌属琼脂培养基（SS）[附录5.12]。 4.10 蛋白胨水培养基[附录5.18]。 4.11 脲（尿素）琼脂培养基[附录5.23]。 4.12 氰化钾培养基[附录5.24]。 4.13 赖氨酸脱羧酶培养基[附录5.25]。 5 对照用菌液 取乙型副伤寒沙门菌[CMCC（B）50094]是营养琼脂斜面培养物少许，接种至5ml营养肉汤培养基内，36℃±1℃培养18～24h后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至1:106（浓度相当于50～100cfu/0.1ml），作阳性对照用菌液。其菌液浓度可用平板菌落计数法测得。即取0.1ml加入平皿内，倾注营养琼脂，混匀，或以0.1ml均匀涂布于事先准备好的营养琼脂平板上，经培养后点计求得。 6 操作方法 6.1 准备工作：（见细菌、霉菌和酵母菌计数6）。 6.2 供试液的制备：（见细菌、霉菌和酵母菌计数7）。 含抑菌成分供试品供试液的制备：（见大肠埃希菌6.2）。 6.3 阳性对照实验、阴性对照实验（见大肠埃希菌7.1）。 6.4 增菌培养 6.4.1 预增菌 取营养肉汤培养基2份，每份200ml，1份加入10g或者10ml供试品使匀，另1份加入稀释剂10ml作阴性对照，36℃±1℃培养18～24h，观察。摇动阴性对照瓶后应清亮透明，无菌生长。 6.4.2 增菌培养 轻微摇动供试品增菌培养瓶，吸取1ml接种于1管含10ml四硫磺酸钠亮绿培养基的试管中，培养18～24h。 6.5 分离培养 轻微摇动供试品增菌培养，以接种环沾取1～2环培养液划线于胆盐硫乳琼脂（DHL）或沙门菌志贺菌琼脂（SS）平板及曙红亚甲蓝（EMB）琼脂或麦康凯琼脂平板各1个，倒置培养24～48h。检查平板上有无疑似沙门菌菌落。沙门菌在上述平板上的菌落形态特征见表1。 表1 沙门菌的菌落特征 平板 菌落形态 胆盐硫乳琼脂（DHL） 无色至浅橙色，半透明，菌落中心带 黑色或全部黑色或无黑色 沙门菌属志贺菌属琼脂（SS） 无色至淡红色，半透明或不透明，菌落中心有时带黑褐色 曙红亚甲蓝琼脂（EMB） 无色至浅橙色，透明或半透明，光滑湿润的圆形菌落 麦康凯琼脂（MacC） 无色至浅橙色，透明或半透明，菌落中心有时为暗色 由于沙门菌不发酵乳糖和蔗糖，不产酸，菌落不着色，一般为无色半透明，多数沙门菌因产生H2S，菌落中心呈现黑色甚至全黑色，在DHL琼脂平板上较为明显。在SS琼脂平板上，H2S特征有时不明显，沙门菌属亚属Ⅲ因多数菌株发酵乳糖，故在上述平板上的乳糖发酵菌落呈现粉红或紫色，但由于产生H2S，在有H2S指示系统