氨基酸和蛋白质药物的分析.pptVIP

胰岛素效价检测方法 胰岛素效价检测方法较多，目前各国药典比较普遍采用的是生物检测法。 近年来国内外所用新的检测方法： 放射受体分析 免疫火箭电泳法 高效液相色谱法 检测法 1．生物检测法 ：兔血糖法，此法是将胰岛素标准品和供试品分别注入家兔皮下，比较二者使家兔血糖降低的程度来决定供试品效价。小鼠惊厥法及小鼠血糖法。 2、放射受体分析法 ：灵敏度高，一般能达到ng、pg甚至fg的水平；特异性强，样品中的待测物质不需提取或纯化；简便，可大批检测样品，省人力，便于标准化、药盒化和自动化等。 胰岛素与受体结合有饱和性。将碘标记胰岛素后与受体结合，天然胰岛素可以取代与受体结合的碘化胰岛素，当碘化胰岛素与受体的量固定时，碘化胰岛素—受体复合物就随天然胰岛素浓度的增加而减少，并呈一定函数关系。 3．理化测定方法 理化测定方法 （1）紫外分光光度法：重复性好，回收率。 （2）火箭电泳法：特异性强，不受其它组分的干扰，适用胰岛素生产的中间检测。 （3）高效液相色谱法：1985年Smith等用RP-HPLC法，以标准峰面积对效价作标准曲线，测定了胰岛素的效价。此法样品用量少，并可批量检测，时间仅为生物检测法的1/60，同时还能获得对胰岛素纯度评估必不可少的杂质种类及含量的信息。 高效液相色谱法 层析条件： Monc QRH5/5色谱柱， 流动相A：20mmol/L Tris-HCl ， 流动相B：流动相含0.5mol/L NaCl， 检测波长280nm； 线性NaCl梯度如下：0min：100%A，0%B； 20min：60%A，40%B。 样品测定 标准曲线制备：精密称取胰岛素标准品用流动相A配成浓度梯度。 分别进样50μl， 按上述层析条件进行色谱分析。 以胰岛素峰面积对浓度作图，浓度与峰面积成线性关系。 样品测定： * 硫酸钾的作用是提高硫酸的沸点，硫酸加热容易分解，加入硫酸盐提高沸点。 硫酸铜固体粉末，加速剂，防暴。 * 常量和半微量：250-500,25-50ML （一）茚三酮法 （二）三硝基苯磺酸法 （三）铜复合物紫外吸收法 （四）甲醛滴定法 （五）非水溶液滴定法 （六）双波长分光光度法 （七）导数分光光度法 （八） HPLC法 （一）茚三酮法 当茚三酮在酸性条件下和氨基酸反应时，氨基酸被氧化分解生成醛，放出氨和二氧化碳，水合茚三酮则成还原型水合茚三酮。 还原型茚三酮与氨及另一分子茚三酮缩合生成蓝紫色的，最大吸收值的波长为570 nm。 测定范围是0.5-50μg氨基酸。 （二）三硝基苯磺酸法 TNBS在偏碱性的条件下与氨基酸反应，先形成中间络合物。 中间络合物有二个吸收峰，位于355nm和420nm附近。 酸性溶液中，中间络合物转化成TNB-氨基酸，吸收值移至340nm处。 （三）铜复合物紫外吸收法 在合适的pH条件下，二分子α-氨基酸与一分子铜离子形成氨基酸-铜复合物。 复合物呈蓝色，除了在620nm有吸收峰外，在230nm有最大吸收。 测定范围是50-500 μmol/ml。 适用于蛋白质水解速度和水解程度的测定。 （四）甲醛滴定法 在pH中性和常温条件下，甲醛迅速与氨基酸上的氨基结合，使平衡向右移动，促进氢离子释放，使溶液酸度增加。 可用酚酞作指示剂，以氢氧化钠来滴定。 每释放出一个氢离子，就相当有一个氨基氮。 （五）非水溶液滴定法 非水溶液滴定法：是氨基酸在冰醋酸中用高氯酸的标准溶液滴定其含量。 酸碱的质子学说：一切能给出质子的物质为酸，能接受质子的物质为碱。 弱碱在酸性溶剂中碱性显得更强，而弱酸在碱性溶剂中酸性显得更强。 适合于氨基酸成品的含量测定，测定范围是几十毫克的氨基酸。 非水溶液滴定法 直接滴定法：适用于能溶于冰醋酸的氨基酸。丙氨酸、精氨酸、组胺酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、苏氨酸等。 回滴法：适用于不能溶于冰醋酸而能溶于高氯酸的氨基酸。赖氨酸、丝氨酸、半胱氨酸等。 第四节 蛋白质类药物的含量测定 凯氏定氮法 双缩脲法 福林酚法 紫外光吸收法 考马斯亮蓝G-250法 BCA法 凯氏定氮法 原理： 当蛋白质与浓硫酸共热时，被氧化为二氧化碳和水，而氮转化为氨，氨与硫酸结合成硫酸胺，此过程称为“消化”。硫酸铜用作催化剂。 消化完成后，消化液转入凯氏定氮仪反应室中，加入过量浓氢氧化钠，