免疫共沉淀Co-IP实验操作步骤.pdf

免疫共沉淀 Co-IP 实验操作步骤 一、原理： 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation ）是以抗体和抗原之间的与一性作用为基础 的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用 植 的有效方法。其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质 仅 物 限 科 －蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X 的抗体免疫沉淀 X ，那么不X 在体 自 学 内结合的蛋白质 Y 也能沉淀下来。目前多用精制的 prorein A 预先结合固化在 argarose 用 最 前 的 beads 上，使之不含有抗原的溶液及抗体反应后，beads 上的 prorein A 就能吸附抗原 ，不 沿 达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一 准 微 种特定蛋白质的新的作用搭档。 商 信 用 公 其优点为：（1 ）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2 ）蛋白 众 的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3 ）可以分离得到天然状态 号 粉 的相互作用蛋白复合物。缺点为：（1 ）可能检测丌到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质 丝 相互作用；（2 ）两种蛋白质的结合可能丌是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作 提 供 用；（3 ）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测丌 正确，实验就得丌到结果，方法本身具有冒险性。 二、准备工作： RIPA Buffer ，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机 预冷 PBS ， 1. 用预冷的 PBS 洗涤细胞两次，最后一次吸干 PBS ； 2. 加入预冷的 RIPA Buffer(1ml/107 个细胞、10cm 培养皿或 150cm2 培养瓶， 0.5ml/5×106 个细胞、6cm 培养皿、75cm2 培养瓶) 3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到 1.5EP 管中，4℃， 缓慢晃动 15min （EP 管插冰上，置水平摇床上） 植 4. 4℃ ，14000g 离心 15min ，立即将上清转移到一个新的离心管中 仅 物 限 科 5. 准备 Protein A agarose ，用PBS 洗两遍珠子，然后用 PBS 配制成 50%浓度，建 自 学 议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠 用 最 前 6. 每 1ml 总蛋白中加入 100μl Protein A 琼脂糖珠（50% ），4℃摇晃 10min （EP ，不 沿 管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景