拟南芥培养转化的流程[1](1).docVIP

拟南芥转化实验流程 1．拟南芥正常培养 拟南芥生长的适宜温度白天为22℃-24℃，夜温比日温低2℃，适宜的湿度为60-70%，生长期适宜的光强为150μmo1·s-1·m-2，幼苗期不耐高光强，可适当遮荫，光质选用植物生长专用的日光灯。拟南芥生长室的日照长度定于14-16h。 培养基配制： MS+Sucrose（30g/L）+agar（0.7-0.8%），将pH调到5.7，灭菌后，在超净台上分装入培养皿中。 种子消毒：种子放在l.5m1离心管中，加入1ml 10%NaClO+Triton，混匀，消毒10-15min，用无菌水洗5次以上（用移液枪吸）。 播种：用移液枪将种子吸到培养皿上，可多加些水，将种子铺均匀，用移液枪吸干水，在超净台上让培养皿干了，密封盖子，4℃暗处理2天后，移到光照培养箱（22℃，光周期12h）。 移苗 将营养土与蛭石按（1：1）的比例混好，装入花盆，将花盆放入有水的塑料周转框中，框中的水就会通过花盆底部的孔渗上来，待花盆中的基质湿透后即可移苗。 轻轻用镊子从培养皿中连根拉出小苗，把根平放在基质表面，用镊子把根轻轻压下。 移苗结束后，用保鲜膜覆盖3-4天后揭膜，从苗期直至开花，可在塑料周转框中始终保持1-3cm的水层。 在开始收籽期，不再需要过多的水分，可保持塑料周转框干燥，此时每隔2-3天浇一次水即可。整个生长期可浇3-4次拟南芥营养液。 收种：待拟南芥果荚变黄、变干时，就可以收种子。将种子抖落在纸上，用滤网过一下以除去杂质，将种子装入写了标记的小纸袋中，放于干燥的环境中让种子进一步干燥后，封存于1.5m1离心管中。 2. 拟南芥转基因 按上述方法培养拟南芥，约3星期左右，剪去已经开花的主茎，抑制顶端优势。约4星期左右，抽出的侧枝大量开花，此时正是浸润法转基因的最佳时机。 取-70℃保存的农杆菌菌液20μ1，加入5mIYEB ( yeast extract l0g/L,Tryptone l0g/L,Nacl 5g/L,灭菌，添加壮观霉素和利福平)，28℃恒温振摇过夜。 将此5m1菌液倒入250mlYEB(添加壮观霉素和利福平，28℃恒温振摇过夜，此时，农杆菌的浓度应达到OD600=1.8。 4000rpm离心15分钟，弃去上清，加入浸润培养基(1/2MS大量++1/2MS微量+1/2MS铁盐+1xMS肌醇+1x MS维生素+Sucrose5%，pH5.7)。将农杆菌重悬于浸润培养基，并加入表面活性剂Silwet，使其终浓度达到0. 02％(每升加200μ1)。（浸润培养基也可用新鲜配制的5％蔗糖溶液代替，参见实验流程Steve Clough and Andrew Bent, University of Illinois at Urbana-Champaign） 将拟南芥花盆蒙上纱布，用橡皮筋扎紧，以免花盆倒扣时培养基质下漏。将花盆倒扣于装有250m1菌悬液的培养皿上，将拟南芥倒置，使花蕾朝下并浸入渗透液中，保持5min。 转化后的植株平放，盖好保鲜膜。低光强度下生长24-48h后置于正常光照条件下生长，直到开花结荚收集种子。 本方法由徐重益博士提供，毛新国整理。 ? MS培养基成分 分子量 使用浓度(mg/L) 大量元素 硝酸钾　KNO3 101.11 1900 硝酸铵　NH4NO3 80.04 1650 磷酸二氢钾　KH2PO4 136.09 170 硫酸镁　MgSO4.7H2O 246.47 370 氯化钙　CaCl2.2H2O 147.02 440 ? ? ? 微量元素 碘化钾　KI 166.01 0.83 硼酸　H3BO3 61.83 6.2 硫酸锰　MnSO4.4H2O 223.01 22.3 硫酸锌　ZnSO4.7 H2O 287.54 8.6 钼酸钠　Na2MoO4.2 H2O 241.95 0.25 硫酸铜　CuSO4.5 H2O 249.68 0.025 氯化钴　CoCl2.62 237.93 0.025 ? ? ? 铁盐 乙二胺四乙酸二钠　Na2.EDTA 372.25 37.3 硫酸亚铁　FeSO24.7H2O 278.03 27.8 ? ? ? 有机成分 肌醇 ? 100 甘氨酸 ? 2 盐酸硫胺素　VB1 ? 0.1 盐酸吡哆醇　VB6 ? 0.5 烟酸　VB5或VPP ? 0.5 ? ? ? ? 蔗糖　sucrose 342.31 30g/L ? ? ? ? 琼脂　agar ? 7 g/L