染色质免疫共沉淀（ChIP）实验.docxVIP

染色质免疫共沉淀（ChIP） 染色质免疫共沉淀可以：（1）组蛋白修饰酶的抗体作为“生物标记”；（2）转录调控分析；（3）药物开发研究；（4）DNA损失与凋亡分析。 1实验方法原理： 在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。 IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。 目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。 2实验材料、试剂、仪器耗材： 细胞样品 甲醛、甘氨酸、PBS、SDS、 Lysis Buffer、洗脱液、RNaseA、蛋白酶K、omega胶回收试剂盒等 离心管、超声仪、电泳仪、离心机等 3实验步骤： 一、细胞的甲醛交联与超声破碎（ 第一天） 1. 取出1平皿细胞（10 cm平皿），加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有9 ml）。 2. 37℃孵育10 min。 3. 终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125 M。450 ul 2.5 M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5 min即可。 4. 吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。 5. 细胞刮刀收集细胞于15 ml离心管中（PBS依次为5 ml，3 ml和3 ml）。预冷后2 000 rpm 5 min收集细胞。 6. 倒去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100 ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80%。即为4×106个细胞。因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起，共800 ul。 7. 超声破碎：VCX750，25%功率，4.5 s冲击，9 s间隙。共14次。 二、除杂及抗体哺育 （ 第一天） 1. 超声破碎结束后，10 000 g 4℃离心10 min。去除不溶物质。 2. 留取300ul做实验，其余保存于-80℃。 3. 300 ul中，100 ul加抗体做为实验组；100 ul不加抗体做为对照组；100 ul加入4 ul 5 M NaCl（NaCl终浓度为0.2 M），65℃处理3 h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。 4. 在100 ul的超声破碎产物中，加入900 ul ChIP DilutionBuffer和20 ul的50×PIC。 再各加入60 ul ProteinA Agarose/SalmonSpermDNA。4℃颠转混匀1 h。 5. 1 h后，在4℃静置10 min沉淀，700 rpm离心1 min。 6. 取上清。各留取20 ul做为input。一管中加入1 ul抗体，另一管中则不加抗体。4℃颠转过夜。 三、检验超声破碎的效果 （ 第一天） 1. 取100 ul超声破碎后产物，加入4 ul 5M NaCl，65℃处理2 h解交联。 2. 分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。 四、免疫复合物的沉淀及清洗（ 第二天） 1. 孵育过夜后，每管中加入60 ul ProteinA Agarose/SalmonSperm DNA。4℃颠转2 h。 2. 4℃静置10 min后，700 rpm离心1 min。除去上清。 3. 依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在4℃颠转10 min，4℃静置10 min沉淀，700 rpm离心1 min，除去上清。 洗涤溶液： （1）low salt wash buffer-one wash （2）highsalt wash buffer-one wash （3）LiCl wash buffer-one wash （4）TE buffer-two wash 4. 清洗完毕后，开始洗脱。 洗脱液的配方：100 ul 10%SDS，100 ul1M NaHCO3，800 ul ddH2O，共1 ml。 每管加入250 ul洗脱buffer，室温下颠转15 min，静置离心后，收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500 ul。 5. 解交联：每管中加入20 ul 5M NaCl（NaCl终浓度为0.2 M）。 6. 混匀，65℃解交联过夜。 五、DNA样品的回收（第三天） 1. 解交联结束后，每管加入1 ul RNaseA（MBI），37℃孵育1 h。 2. 每管加入10 ul 0.5 M EDTA，20 ul1M Tris.HCl（PH6.5），2 ul 10