生理生化实验手册-.doc

《生理生化》 实 验 手 册 设施园艺课题组PBS（磷酸盐缓冲液）配制 贮备液A：0.2M NaH2PO4(NaH2PO4.H2O 27.6g—1000ml or NaH2PO4.2H2O 31.2g—1000ml) 0.2M KH2PO4 27.22g—1000ml 贮备液B: 0.2M Na2HPO4.7H2O 53.61g OR Na2HPO4·12H2O 71.63g—1000ml 0.2M K2HPO2.3H2O 45.64g—1000ml Xml A + Yml B稀释成200ml （0.1M） PH X Y PH X Y 5.7 93.5 6.5 6.9 45 55 5.8 92 8 7 39 61 5.9 90 10 7.1 33 67 6 87.7 12.3 7.2 28 72 6.1 85 15 7.3 23 77 6.2 81.5 18.5 7.4 19 81 6.3 77.5 22.5 7.5 16 84 6.4 73.5 26.5 7.6 13 87 6.5 68.5 31.5 7.7 10.5 89.5 6.6 62.5 37.5 7.8 8.5 91.5 6.7 56.5 43.5 7.9 7 93 6.8 51 49 8 5.3 94.7 抗氧化酶活性及MDA、蛋白含量测定 提取：0.3g叶片，2ml 50mM(含0.2 mM EDTA，2% PVP) PH 7.8磷酸缓冲液。如果要测APX， 则缓冲液中加入ASA(0.0352克加入到100ml缓冲液中)，冰浴研磨，12000g离心20分钟，取上清，此上清液用于测定各种酶与MDA含量! 0.1M PBS（pH 7.8）：8.5 ml 0.2 M A+91.5 ml 0.2 M B稀释成200ml 50 mM PBS（pH 7.8，含0.2mM EDTA）：100 ml 0.1M PBS+0.0116g EDTA，定容至200 ml，调pH至7.8 25 mM PBS（pH 7.8，含0.2mM EDTA）：25ml 0.1M PBS+0.0058g EDTA，定容至100 ml，调pH至7.8 25 mM PBS(pH 7.0，含0.1mM EDTA)：39ml0.2M A+61ml0.2M B稀释至25mM 1. 抗坏血酸过氧化物酶 (APX) 反应混合液：25mM PBS(PH7.0,含0.1 mM EDTA) ，1.0 mM H2O2， 0.25mM ASA，酶液，总体积2000 ul，290 nm比色，时间扫描。 PBS 1700 ul 5mM ASA 100 ul （0.0088g 溶于10ml ddw，遮光） 20 mM H2O2 100 ul (20.4ul 30%H2O2 溶于10ml ddw) 酶液 100 ul 2. 单脱氢抗坏血酸还原酶 (MDAR) 反应混合液：25mM PBS(PH7.8,含0.2 mM EDTA)，0.1mM AsA，0.5单位的AsA氧化酶，0.1mM NADH和100ul酶液，总体积2000 ul，340nm比色，时间扫描。 2 mM AsA：0.0035g ASA溶于10ml DDW PBS(含EDTA) 1700ul 2 mM AsA 100 ul AsA氧化酶 50 ul (sigma整瓶粉末加1.62ml ddH2O，稀释10倍使用) 4 mM NADH 50 ul （0.0284g溶于10ml ddw） 酶液 100 ul 3. 脱氢抗坏血酸还原酶 (DHAR) 反应混合液：25mM PBS(PH7.0,含0.1 mM EDTA)，3.5mM GSH,0.4 mM DASA，酶液，总体积2000 ul，265nm比色，时间扫描。 PBS 1700ul 70 mM GSH 100 ul (0.129g 溶于6ml ddw) 8 mM DASA 100 ul (0.0084g 溶于 6ml ddw) 酶液 100 ul 4. 谷胱甘肽还原酶 (GR) 反应混合液：25mM PBS (PH 7.8,含0.2 mM EDTA) 0.5Mm GS