实验室生理生化指标实验简略步骤(1).docVIP

叶绿素含量的测定 (赵世杰2000，改进的方法) 【仪器】分光光度计、电子顶载天平（感量0.01g）、具塞试管、吸水纸、滴管、剪刀、试管18*3=54 【试剂】95％乙醇【操作步骤】1.叶绿素的提取：取新鲜小麦叶片洗净，用滤纸擦干，去除中脉剪碎。称取剪碎的新鲜样品0.05g，放入20ml具塞试管中，加入5ml 95%的乙醇 (塞上塞子，避光保存)，摇晃后避光浸提48 2.测吸光度：取叶绿体色素提取液1ml，加95%的乙醇3ml稀释后，在波长665nm、649nm 和470nm 下测定吸光度，以95％乙醇为空白对照。 【结果计算】 Ca=13.95OD665-6.88OD649 Cb=24.96OD649-7.32OD665 Cxc=（1000OD470-2.05Ca-114.8Cb）/245 Ca、Cb、Cxc分别为叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的总浓度，单位mg/L 色素含量（mg/g.FW）)= 可溶性蛋白质含量的测定 （read 考马斯亮蓝G-250） 【仪器】分光光度计、低温高速离心机、电子天平、研钵等、比色计、移液管、试管18*3=54 【试剂】 （1）95%乙醇； （2）磷酸（85%，W/V）。 （3）考马斯亮蓝G-250：称取0.05g考马斯亮蓝G-250溶于25ml 95%乙醇中，加入85%（W/V）磷酸50ml，最后用蒸馏水定容至500ml（搅拌下过夜放置）。此溶液贮存棕色瓶中， 【操作步骤】 1.样品提取： 取小麦叶片洗净，擦干，去掉中脉，剪碎，取0.1g放入研钵中，加入1ml蒸馏水冰浴研磨后定容至1.5ml，在4oC 4000转/每分下离心15分钟，取上清液用于测定可溶蛋白含量。 2.样品提取液中蛋白质浓度的测定 吸取样品提取液0.02ml，放入具塞刻度试管中（设3个重复管），加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，充分混合，放置2min后在595nm下比色（1h内稳定），记录吸光度值，通过标准曲线查得蛋白质含量。 【结果计算】 样品蛋白质含量（mg/g鲜重）= （C×V/a）/W （C×V/a）/W C－查标准曲线所得每管蛋白质含量（μg） V－提取液总体积（5ml） V’－测定所取提取液体积（0.1ml） W－样品鲜重（0.1g） 丙二醛含量的测定 (中国植物生理研究所，上海市植物生理学会编 现代植物生理学实验指南11-7p305) 【仪器】分光光度计、低温高速离心机、电子天平、研钵等、比色计、移液管、试管18*3=54 【试剂】 10%三氯乙酸（TCA）：25g三氯乙酸溶于250ml蒸馏水；(5ml*18=90ml+130ml=220ml) 0.6%硫代巴比妥酸(TBA)：先加少量的氢氧化钠（1mol/L）溶解，再用10％的三氯乙酸定容。 0.78g TBA 130ml（现用现配） 【操作步骤】 1. MDA的提取 称取剪碎的小麦叶片0.2g，加入1ml 10％TCA和少量石英砂，研磨至匀浆，再加3ml TCA进一步研磨，匀浆转移至15ml离心管，再用1mL 10%TCA洗研钵并入离心管，离心（4000×g） 2. 显色反应和测定 吸取离心的上清液2ml（对照加2ml蒸馏水），加入2ml 0.6%巴比妥酸（TBA溶液用10%TCA配置），混匀物于沸水浴上反应15min，迅速冷却后3500转/分离心10min.取上清液于入532、600、450nm处测其光密度值。 【结果计算】 MDA浓度(μmol/L)=6.45(D532-D600)-0.56D450 MDA含量(μmol/g FW)＝ 可溶性糖含量的测定 (陈毓荃主编。实验三十四 可溶性糖总量的测定。生物化学试验方法和技术。北京：科学出版社171-174) 【仪器】分光光度计、天平、恒温水浴锅、移液管、漏斗、试管18*3=54 【试剂】 蒽酮试剂：称取0.3g蒽酮结晶粉末，溶解于300ml稀硫酸溶液（80%）中即得。稀硫酸溶液由228ml浓硫酸（比重1.84）加蒸馏水72ml稀释成300ml，冷却至室温，贮存于棕色瓶内，冰箱保存，可使用2~3 【操作步骤】 1.样品中可溶性糖的提取： 称取剪碎混匀的小麦叶片0.1g，放入大试管中，加入8mL 蒸馏水，加盖，在沸水浴中煮沸20 min，取出冷却，过滤入15 mL刻度试管中，用蒸馏水冲洗残渣数次，定容至10ml。 2测定： 取浸提液0.2ml+0.8ml蒸馏水＋5ml蒽酮试剂(三次重复)，同时作一空白对照（1ml蒸馏水＋5ml蒽酮试剂），将各管快速摇动混匀后，在沸水浴中煮 10 min ，取出自来水冷却，用空白对照调零在 620 nm 波长下测定吸光度值. 【结果计算】植物样品含糖量（%