小麦成熟胚标准技术规程(1).docVIP

小麦成熟胚标准技术规程 成熟胚所采用的培养基的选择 MS基本培养基为主 二、主要基本设备的使用 超净工作台、培养皿、解剖针、解剖刀、镊子、过滤灭菌器、酸度计、电子天平、高压蒸汽灭菌锅、冰箱、培养室 超净工作台：在开始接种操作之前，要开启10－15min紫外灯灭菌。 三、小麦成熟胚愈伤组织诱导 选取饱满、大小一致的小麦种子，用70％的酒精浸泡5min，再用0.1％的HgCl2浸泡20－25分钟，无菌水冲洗4－5次，然后于无菌水中浸泡16－20小时，接种前再用0.1％的HgCl2消毒5分钟，无菌水冲洗4－5次，剥取成熟胚接种于培养基中（盾片向上）。25℃暗培养2－4周 2、愈伤组织的继代培养 将愈伤组织于继代培养基上进行扩大培养，25℃暗培养2周。 3、农杆菌与愈伤组织的共培养 （1）将继代愈伤组织转入预培养基上，28℃暗培养7天； （2）挑取保存的农杆菌菌液接种于含有50mg/L Kan、25ug/ml利福平的LB固体培养基中。于28℃，培养2－3天； （3）挑取单胞到另一新的含有50mg/L Kan、25ug/ml利福平的LB固体培养基中划线复壮； （4）农杆菌长好后，直接用悬浮培养基洗脱，测OD600=0.6－0.8之间； （5）将菌液加入并浸没已预培养的愈伤组织，25－30分钟； （6）将浸染的愈伤组织在灭菌好的滤纸上阴干，放入共培养基中，28℃，暗培养3天； 4、抗性愈伤组织的筛选； 将共培养后的愈伤组织在无菌水中清洗4－5次，再浸入含有400ppm的羧苄青霉素中，10－30min；滤纸上阴干，放入第一次筛选培养基，26℃光培养2周，再转入到第二次筛选培养基，26℃培养2周。 5、抗性愈伤组织的分化 将新生的抗性愈伤组织转移到分化培养基上，26℃光照培养，分化成苗 6、生根培养 分化成苗的幼苗转移到生根培养基中，26℃光照培养，待根系生长良好，幼苗长壮后，打开瓶盖，练苗3－7天；洗去根系培养基，盆栽或移栽到大田。 四、培养基的制备： 诱导培养基： Msmax+Msmin＋MS有机＋Fe-EDTA+ 2mg/L 2,4-D+ CH(200mg/L)+谷氨酰氨(20mg/L)＋S（30g/L）＋琼脂粉（8g/L）PH=5.8 继代培养基：同诱导培养基，但2,4-D为1mg/L。 预培养基： 1/2Msmax+1/2Msmin＋MS有机＋Fe-EDTA+ 2mg/L 2,4-D+ CH(200mg/L)+谷氨酰氨(20mg/L)＋甘露醇(0.4mol／L) +S（30g/L）＋琼脂粉（8g/L）PH=5.8.高温灭菌后，每升加入AS（0.2mmol/L） 悬浮培养基： 1/2Msmax+1/2Msmin＋MS有机＋Fe-EDTA+ 2mg/L 2,4-D+ CH(200mg/L)+谷氨酰氨(20mg/L)＋S（30g/L）＋琼脂粉（8g/L）PH=5.8. 高温灭菌后，每升加入AS（0.2mmol/L） 共培养基： 1/2Msmax+1/2Msmin＋MS有机＋Fe-EDTA+ 2mg/L 2,4-D+ CH(200mg/L)+谷氨酰氨(20mg/L)＋100mg/L VC＋S（30g/L）＋琼脂粉（8g/L）PH=5.8. 高温灭菌后，每升加入AS 100umol/L 筛选培养基： 第一次筛选培养基： Msmax+Msmin＋MS有机＋Fe-EDTA+ 2mg/L 2,4-D+ CH(200mg/L)+谷氨酰氨(20mg/L)＋S（30g/L）＋琼脂粉（8g/L）PH=5.8。灭菌后加入Kan 200mg/L+200 mg/Lcarb+200 mg/L Cefo 第二次筛选培养基：与第一次筛选培养基基本相同，只是Kan增加一倍。 分化培养基： Msmax+Msmin＋MS有机＋Fe-EDTA + 6-BA(2 mg/L)+KT(2 mg/L)+0.2mg/L IAA+0.2mg/LNAA+CH(200mg/L)+谷氨酰氨(20mg/L)＋S（30g/L）＋琼脂粉（8g/L）PH=5.8 生根培养基： 1/2Msmax+1/2Msmin＋MS有机＋Fe-EDTA＋S 20g/L+4mg/L多效唑＋琼脂粉（8g/L）PH=5.8 附件 MS培养基母液的配置（单位：mg ml） 母液 成　分 规定量 浓缩 倍数 称取量 母液 体积 配制1升培养基吸取量定容 编号 种类 = 1 \* ROMAN I 大量元素 KNO3 1900 10× 19000 1000 100 NH4NO3 1650 16500 MgSO4·7H2O 370 3700 KH2PO4 170 1700 CaCl2·2H2O 440 4400 = 2 \* ROMAN II 微量元素 MnSO4·4H2O 22.3 100×