双分子荧光互补实验原理 - 副本(1).docVIP

双分子荧光互补 双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation，BiFC)分析技术，是由Hu等在2002年 最先报道的一种直观、快速地判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用的新技术·该技术巧妙地将荧光蛋白分子的两个互补片段分别与目标蛋白融合表达，如果荧光蛋白活性恢复则表明两目标蛋白发生了相互作用·其后发展出的多色荧光互补技术(multicolor BiFC)，不仅能同时检测到多种蛋白质复合体的形成，还能够对不同蛋白质间产生相互作用的强弱进行比较·目前，该技术已用于转录因子，G蛋白βγ亚基的二聚体形式，不同蛋白质间产生相互作用强弱的比较以及蛋白质泛素化等方面的研究工作上· BiFC技术原理 将 \t /_blank 蛋白在某些特定的位点切开，形成不发荧光的N和C端2个多肽，称为N片段(N-fragment)和C片段(C-fragment)。这2个片段在细胞内共表达或体外混合时，不能自发地组装成完整的荧光蛋白，在该荧光蛋白的激发光激发时不能产生荧光。但是，当这2个荧光蛋白的片段分别连接到1组有相互作用的目标蛋白上，在细胞内共表达或体外混合这2个融合蛋白时，由于目标蛋白质的相互作用，荧光蛋白的2个片段在空间上互相靠近互补，重新构建成完整的具有活性的荧光蛋白分子，并在该荧光蛋白的激发光激发下，发射荧光。简言之，如果目标蛋白质之间有相互作用，则在激发光的激发下，产生该荧光蛋白的荧光。反之，若蛋白质之间没有相互作用，则不能被激发产生荧光。 BiFC技术缘起 蛋白质片段互补技术 BiFC起源于蛋白质片段互补技术。所谓蛋白质片段互补技术(protein fragment complementation)是将某个功能蛋白切成2段，分别与另外2种目标蛋白相连，形成2个融合蛋白。在1个反应体系中，2个目标蛋白的相互作用使得2个功能蛋白质片段靠近、互补，并重建功能蛋白质的活性，通过检测功能蛋白质的活性来判断目标蛋白质的相互作用。已经尝试用于该目的的功能蛋白包括泛素蛋白(ubiquitin)，β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)，二 氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase)，β-内酰胺酶(β-lactamase)，以及几种荧光素酶，如萤火 \t /_blank 虫荧光素酶(firefly luciferase)，海肾 \t /_blank 萤光素酶(renilla luciferase)，甲 \t /_blank 虫荧光素酶(beetle luciferase)和长腹水蚤荧光素酶(gaussia luciferase)。BiFC沿袭了蛋白质片段互补的技术原理。所不同的是蛋白质片段互补技术需要重建断裂蛋白的活性，蛋白活性由底物反应所体现，通过检测底物变化，来判断蛋白质的相互作用。而基于断裂荧光蛋白的BiFC技术则是利用荧光蛋白本身的一个特点，即 \t /_blank 荧光蛋白活性被重建后，能自我催化形成荧光活性中心，重新恢复荧光蛋白的特征光谱，自身作为报告蛋白，直接反映蛋白质之间的相互作用。因此技术过程更加简单，结果更加直观。 \t /_blank 绿色荧光蛋白(GFP)及外源片段插入和循环排列实验GFP是由238个氨基酸残基组成的1个单体蛋白，其三维结构是由11个反向平行的β折叠环绕成1个桶状结构，1个较长的α2螺旋从桶的中心穿过，这些β折叠和α螺旋之间通过Loop环链接起来。荧光蛋白的 \t /_blank 发色团位于桶中心的α螺旋上，由荧光蛋白通过 \t /_blank 自体催化，将3个氨基酸残基Ser652Tyr662 Gly67进行环化，氧化后形成。由于GFP结构致密，不易被蛋白酶水解，且在厌氧细胞以外的任何细胞中都能自我催化发射荧光，所以很快被应用于生命科学研究，将其融合于形形色色的蛋白上，用来研究蛋白质的功能。最初将GFP融合到目标蛋白的方式主要有3种，即N端融合、C端融合、或将整个荧光蛋白插入到目标蛋白中，这3种方式中，GFP蛋白都是完整的。1998年，Abedi等首次尝试了GFP的另类使用方式，即将目标短肽插入到GFP中。他们从GFP的Loop区域选择了10个位点，将20个左右氨基酸组成的短肽分别插入，通过能否 \t /_blank 重新发射GFP的特征光谱，来筛选合适的插入位点(Fig12A)。结果发现，在氨基酸Gln1572Lys158以及Glu1722Asp173之间插入短肽时，GFP仍然能发射荧光。于是，他们以GFP作为支架蛋白(scaffold protein)，用其Gln1572Lys158(此位点较Glu1722Asp173位点更能适应外源短肽)位点来筛选短肽库。1999年，Baird等在对GFP的突