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双酶切连接反应之全攻略 前一阵子一直在做双酶切质粒重组,失败了 很多次,不过很快改善了 实验方法, 用 2 周重组了 14 个质粒。现就自己的体会,结合丁香园战友的宝贵经验,谈一下 质粒重组的一些个人经验。 1、回收PCR 产物：在进行 PCR 扩增时候,给引物两端设计好酶切位点,一般说来, 限制酶的 选择非常重要,尽量选择粘端酶切和 那些酶切效率高的限制酶,如 BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的 BUFFER,以及各酶在公用 植 BUFFER 里的效率。选好酶切位点后,在各个酶的两边加上保护碱基,其原则可参 物 照：/upload/2006/08/13pdf。 仅 双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜,其实完全没有必要, 限 科 我一般酶切 3 个小时,其实 1个小时已经足够。应用大体系,如 100微升。 纯化问题：纯化 PCR 产物割胶还是柱式,我推荐柱式,因为割胶手法不准,很容易 自 学 割下大块的胶,影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物,既然如此,酶 最 切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以,PCR 产物和双酶切产物的纯化均可 用 应用柱式纯化。我用的是 TAKARA 的纯化柱试剂盒 ， 前 酶量的问题：以TAKARA 的为例,其对 1单位酶的定义如下：在 50 μl 反应液中,30 ℃温度下反应 1 小时,将 1 μg 的 λDNA 完全分解的酶量定义为 1 个活性单位 不 沿 (U)。 而该酶浓度约为 15单位/微升,在除外酶降解的 因素外,该酶可分解 15μg 微 的DNA,而一般从 1-4ml 菌液提出的 DNA 约为 3μg,而 PCR 纯化后的产物 （50 体 准 系）约为 3μg,所以即便全部加进去,只要纯化的 质量好,酶切完全切得动。 商 信 2、酶切、回收后的PCR 产物与载体的连接 摩尔比的计算,很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则 非常有必 用 公 要。回收的载体片段：回收的 PCR 产物片段=1：10 ,一般取前者 0.03pmol,后 者取 0.3pmol。 众 pmol 为单位的 DNA 转换为为 µg 单位的 DNA：（X pmoles×长度 bp×650）/ 号 1,000,000 （注：长度 bp×650 是该双链 DNA 的分子量）所得数值即为 µg,也可 粉 以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是 5380bp,则 0.03pmol 为 丝 0.03×5.38×0.66=0.106524µg。 测 DNA 浓度可以在专用机子上测,注意 OD 值,一般约 1.8-2.0.另外,如果嫌麻烦, 提 也可用 MARKER 进行估测,如 MARKER2000,5 微升的 MARKER 每个条带约 50ng。 供 连接反应：TAKARA 的 连接酶上的 说明写的过夜,