石蜡切片操作步骤.docVIP

PAGE PAGE 1 石蜡切片 一、取材 在取材时应注意下列几点： 1.根据研究的目的，选择健全而具有代表性的部位取材 2.取材时要做好记录 3.采取标本前，要根据制片的要求，选择并配制固定液，取材后应立即投入固定液，以防组织自溶和腐败。 二、固定： 卡诺氏液(Carnoys Fluid)；适用范围：适用于胚胎学、细胞学研究。配方如下： (1) 纯酒精 3份； 冰醋酸 1份 或 (2) 纯酒精 6份； 冰醋酸 1份； 氯 仿 3份 处理：固定时间为12—24小时，有的也可缩短.例如根尖可固定15分钟，花药固定1小时，子房可固定12—24小时。固定完毕可用95％或纯酒精洗涤，换二次，经二甲苯与纯酒精等量混合液过渡，二甲苯透明两次，就可进入石蜡中浸蜡。如果不立即制片时，可转入70%酒精中保存。 三、脱水 1、脱水的目的 各种材料经固定与冲洗后，组织中就含有大量水分。水和石蜡是不能溶合的，脱水使组织中的水分完全除去，并使组织变硬。 2、方法：采用梯度酒精脱水，具体见下表： 酒精（％） 85％ 95％ 100％ 100％ 时间（h） 2 2 1.5 1.5 若是95％酒精洗涤后直接进行下一步的话，则从95％的酒精处开始脱水 。 四、透明 1、透明的目的 透明的主要目的是使组织中的酒精被透明剂所替代，使石蜡能很顺利的进入组织中，或增强组织的折光系数，并能和封藏剂混合进行封藏。常用的明透剂有二甲苯、甲苯、苯、氯仿、香柏油和苯胺油等，二甲苯为最常用的透明剂。 2、透明的方法 为了避免组织收缩，在纯酒精或丙酮脱水以后，并不直接移入二甲苯中，其间必须经过几个级度，逐渐置换。酒精与二甲苯混合的比例列表如下： 级别 Ⅰ Ⅱ Ⅲ 纯酒精 1/2 0 0 二甲苯 1/2 1 1 时间（h） 2 1.5 1.5 3、透明时应注意的问题 如脱水不净，用二甲苯透明后，将发生下列不良后果： Ⅰ、如材料内仍留有微量水分，二甲苯就进不去，因此石蜡也不能透入，切片后将在蜡片上出现空洞，影响结果。 Ⅱ、切片内留有微量水分，在封藏以后，就会发生乳白色的云雾状，在显微镜下观察时，可见许多密集水珠把组织掩盖，影响观察。 Ⅲ、二甲苯极易挥发，故在切片透明之后，从染色缸中取出封藏，手续要敏捷，不宜久置，否则待二甲苯挥发干净后，组织就变硬发白。 Ⅳ、.二甲苯极易吸收空气中的水分，故在湿度大的天气，贮有二甲苯的染色缸的盖子周缘可涂少许凡士林，以防止水分的渗入。在封片时也不宜将口鼻过分靠近切片，以免水气侵入，出现白色云雾状。 V、二甲苯必须保持无水、无酸。若用一、二滴石蜡油滴入其中，立即出现云雾状，即表示其中已含有水分，不能再用。 五、浸蜡 将石蜡浸入整个组织的过程称为浸蜡。 1、包埋剂：包埋所用的各种石蜡，其熔点约在50-60 石蜡的选择方法 （1）依所包埋的材料不同而异，软的材料用软石蜡，硬的材料用硬石蜡。一般动物材料最常用的石蜡熔点为52-56℃，植物材料用的石蜡熔点为54 （2）如果需要切很薄的片子(4微米以下)，可用熔点58-60℃的石蜡，较厚的则用熔点52 （3）根据当地当时的气候条件，夏天气温高时，通常用56-58℃的蜡，冬天气温低时用54 2、浸蜡方法 (1) 将组织留在透明剂(如二甲苯)中，在这种冷的透明剂(亦为石蜡溶剂)上轻轻倒上一层已熔化的石蜡，其分量比例约为3：2。 (2) 倒入的石蜡即凝成固体，然后将材料放在35-37℃之间的熔蜡炉内，经一、二天到石蜡不再继续熔化时为止。 (3) 将材料移入56-60℃的恒温箱中停留2—5小时，待石蜡融化后换纯蜡。 (4) 换二、三次新鲜纯石蜡，使留在组织内的透明剂全部排除后即可包埋。 3、浸蜡过程应注意的问题 (1) 尽量保持在较低温度中，以石蜡不凝固为度。 (2)力求在最短时间内完成石蜡的浸透过程。因为温度过高或时间过长都会引起组织变硬、变脆、收缩等，影响制片效果。 六、包埋 所谓包埋就是被石蜡所浸透的组织连同熔化的石蜡，一起倒入一定形状的容器(如纸盒)内，并立即投入冷水中，使它立刻凝固成蜡块的过程。 1、包埋的操作过程 (一) 将组织块进入第3次纯蜡之后，必须做好下列准备工作。 a.将展片台及酒精灯取出，放在熔蜡炉或恒温箱旁。 b.摺包埋用的纸盒并写好标签。 c.检查恒温箱中所熔的新鲜石蜡是否够用 (二) 在组织块已充分浸蜡后，即可进行下列工作： a.在脸盆或水槽内放入冷水备用。 b.打开展片台电源开关，调节温度至40℃ c.将纸盒放在展片台上。 (三) 右手持镊子，左手从恒温箱中取出盛满熔化石蜡的小瓶，并随手将恒