实验室常用分子生物学实验技术.docxVIP

目录 TOC \o 1-3 \h \z \u 1. 实验室常用分子生物学实验技术 2 1.1 常规分子实验操作说明 2 1.1.1 DNA 抽提 2 1.1.2 PCR 3 1.1.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 4 1.1.4 Southern blot 8 1.1.5 RNA抽提及反转录 11 1.1.6 qRT-PCR 15 1.1.8 大肠杆菌转化 18 1.1.9 质粒抽提 19 1.1.10 PCR或者酶切产物回收 21 1.1.11 载体构建： 24 1.1.12 农杆菌转化 26  1. 实验室常用分子生物学实验技术 1.1 常规分子实验操作说明 1.1.1 DNA 抽提 （1）试剂配制 ① 母液的配置 a、1 M Tris-HCl（pH8.5）（1 L） 称量121.1 g Tris碱，加蒸馏水至大概800 mL处，搅拌均匀后，用1N的HCl调节pH值至8.5，定容至1L，灭菌待用。 b、0.5 M EDTA pH8.0 （1 L） 称量0.5 mol的EDTA（因EDTA存在不同的形式，所用试剂质量也不定，试剂标示的分子量除以2，即为所需EDTA试剂的用量），加蒸馏水至大概800 mL处，搅拌均匀后，用NaOH（加固体NaOH约10-12g）调节pH值至8.0，定容至1L，灭菌待用。 ② 2×CTAB提取液配方： 试剂 1L 500 mL 终浓度 CTAB 20 g 10 g 2% 0.5 M EDTA（pH 8.0） 40 mL 20 mL 20 mM 1M Tris-HCl（pH 8.5） 100 mL 50 mL 100 mM NaCl 81.82 g 40.91 g 1.4 M ③ SDS提取液的配制： 试剂 1L 500 mL 终浓度 EDTA（0.5M pH8.0） 100 mL 50 mL 50 mM Tris-HCl（1M PH8.5） 100 mL 50 mL 100 mM SDS 20 g 10 g 2% NaCl 29.2 g 14.6 g 500 mM （2）大豆种子DNA的提取步骤 ① 0.05 g磨碎的材料中加SDS或CTAB提取液600 μL（冬天需预热，确保试剂均匀透明），加入3 μL蛋白酶K（10 mg/mL），混匀，65℃水浴40 min-1h，每隔10 min颠倒混匀一次； ② 加等体积的酚/氯仿（1：1），轻轻颠倒混匀10 min，静置10 min，10,000转离心10 min，取上清，加等体积的酚/氯仿（1：1）混匀，静置10min； ③ 10,000转离心10 min，取上清，加2倍体积的无水乙醇，沉淀； ④ 10,000转离心1 min，倒掉上清，用70%或75%的乙醇洗沉淀两次； ⑤ 风干，加400 μL灭菌的蒸馏水溶解； ⑥ 加2 μL RNA酶（10 mg/mLl），37℃水浴1 h； ⑦ 加等体积氯仿/异戊醇（24：1），摇匀10min，静置； ⑧ 10,000转离心10 min，取上清，加2倍体积的无水乙醇，沉淀； ⑨ 10,000转离心1min，倒掉上清，用70%或75%的乙醇洗沉淀两次； ⑩ 风干DNA，加200 μL无菌蒸馏水溶解，-20℃保存。 注：若不需要长久保存，可将步骤3~7免去。 （3）少量大豆叶片的DNA快速提取 ① 取一分钱硬币大小的幼嫩叶片，放入1.5 mL离心管中，用锥子捣碎，加SDS提取液500 μL（冬天需预热）， 60℃水浴30 min； ② 加等体积的酚/氯仿（1：1），轻轻颠倒混匀10 min，静置10 min； ③ 10,000转离心10 min，取上清，加2倍体积的无水乙醇，沉淀； ④ 10,000转离心1 min，倒掉上清，保留沉淀，用70%或75%的乙醇洗沉淀两次； ⑤ 风干，加200 μL灭菌的蒸馏水溶解，备用 注：此方法要求使用幼嫩叶片，因此田间取材应注意。 1.1.2 PCR （1）反应体系（总体积20 μL） 试剂名称及浓度 每个反应加入体积 终浓度 10× Buffer 2.0 μL 1× dNTP (2 mmol/L) 1.5 μL 150μmol/L Primer (2 μmol/L) 1.5 μL 150pmol/L 模板DNA 4.0 μL Tag (2.5units/μl) 1U 1