染色质免疫共沉淀（ChIP）实验.pdfVIP

染色质免疫共沉淀（ChIP ） 染色质免疫共沉淀可以用来发现： 1.被特定靶蛋白占据的 DNA 序列 2.在指定的细胞条件下，特定蛋白质（如转录因子）在整个基因组上的结合位点和分布 植 3.基因转录和聚合酶活性 仅 物 4.不疾病表型相关的复杂的 DNA/蛋白质相互作用 限 科 5.蛋白质（如组蛋白）的修饰，这可能影响染色质结构和基因表达 自 学 1 实验方法原理： 最 用 在保持组蛋白和 DNA 联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色 ， 前 不 沿 质被切成很小的片断，并沉淀下来。 准 微 IP 是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到 商 信 免疫球蛋白的 FC 片段的现象活用开发出来的方法。 用 公 目前多用精制的 prorein A 预先结合固化在 argarose 的 beads 上，使之不含有抗原的溶液 众 号 及抗体反应后，beads 上的 prorein A 就能吸附抗原达到精制的目的。 2 实验材料、试剂、仪器耗材： 粉 细胞样品 丝 提 甲醛、甘氨酸、PBS、SDS、 Lysis Buffer、洗脱液、RNaseA、蛋白酶 K、omega 胶回收 供 试剂盒等 离心管、超声仪、电泳仪、离心机等 3 实验步骤： 一、细胞的甲醛交联与超声破碎（ 第一天） 1. 取出 1 平皿细胞（10 cm 平皿），加入 243 ul 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为 1% （培 养基共有 9 ml ）。 2. 37℃孵育 10 min。 3. 终止交联：加甘氨酸至终浓度为 0.125 M。450 ul 2.5 M 甘氨酸于平皿中。混匀后，在 植 室温下放置 5 min 即可。 仅 物 4. 吸尽培养基，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 次。 限 科 5. 细胞刮刀收集细胞于 15 ml 离心管中（PBS 依次为 5 ml ，3 ml 和 3 ml ）。预冷后2 000 自 学 rpm 5 min 收集细胞。最 用 6. 倒去上清。按照细胞量，加入 SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每 200ul 含 2×106 ， 前 不 沿 个细胞。这样每 100 ul 溶液含 1×106 个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设 MCF7 准 微 长满板为 5×106 个细胞。本次细胞长得约为 80%。即为 4×106 个细胞。因此每管加入 400 商 信 ul SDS Lysis Buffer。将 2 管混在一起，共 800 ul。