拟南芥原生质体分离与转化-作物逆境分子生物学实验室优化版.docxVIP

PAGE 1 原生质体分离与转化实验药品 用途 药品名称 公司 货号 规格 单价 备注 质粒提取 葡萄糖 Tris-HCl EDTA NaOH SDS 乙酸钾 冰乙酸 溶菌酶 乙醇 异丙醇 NaCl CsCl EB 异戊醇 NaOAc.3H2O 原生质体分离转化 MES 4-morpholineethanesulfonic acid Sigma Mannitol Sigma M4125-500G 500g 199 9.5折 CaCl2 Sigma C7902-500G 200g 299 9.5折 KCl Sigma P3911-500G 500g 680 9.5折 MgCl2 Sigma M0250-500G 500g 616 9.5折 PEG4000 Sigma 95904-250G-F 250g 414 9.5折 NaCl Sigma S9888-500G 500g 435 9.5折 β-Mercaptoethanol Sigma M6250-100ML 100ml 370 9.5折 10% BSA Sigma V900933-100G 100g 799 9.5折 Cellulase R10 YAKULT L0012-5g 5g 1,250 6折 Macerozyme R10 YAKULT L0021-5g 5g 1,250 6折  用于原生质体转化的质粒制备及纯化 缓冲液和溶液配制 STE缓冲液： 10mmol/L Tris-Cl(PH 8.0) 0.1mol/L NaCl 1mmol/L EDTA(PH 8.0) 溶液I：蒸汽灭菌15min，4℃保存。 50mmol/L 葡萄糖 25mmol/L Tris-HCl （pH8.0） 10mmol/L EDTA （pH8.0） 溶液II：现用现配，室温下使用 0.2 N NaOH 1% （m/V）SDS 溶液III：4℃保存，用时置于冰浴中 5mol/L 乙酸钾 60ml 冰乙酸 11.5ml ddH2O 28.5ml 5. 溶菌酶 （10mg/ml）：使用前用10mM Tris-Cl（pH8.0）溶解，配制成10mg/ml储存液。 6. 异丙醇 7. 70%乙醇 8. TE缓冲液（pH8.0） 10mmol/L Tris-Cl(PH 8.0) 1mmol/L EDTA(PH 8.0) 9. CsCl 10. 10 mg/ml EB：100ml ddH2O中加入1g EB，搅拌数小时，充分溶解，棕色瓶保存。 11. 注射器（10ml、5ml、2.5ml、1.5ml） 12. 异戊醇 13. 无水乙醇 14. 3M NaOAc（pH5.2）：NaOAc.3H2O 40.8g，加冰乙酸至pH5.2，定容至100ml，高压灭菌，室温保存。  实验步骤 （一）质粒DNA粗提取 挑取单菌落接种到30ml含抗生素的LB培养基中，37℃ 200r/min 培养至OD600=0.6。 注: a. 试管的体积应该至少比细菌培养物的体积大4倍。 b. 试管不宜盖的太紧 c. 应在剧烈振摇下温育 取25ml菌液接种于500ml 含抗生素的LB液体培养基中， 37℃ 200r/min 培养约2.5h。 注：最后菌液的OD600值应为0.4。由于不同菌株生长速度不同，可稍微延长或缩短培养时间，使最终OD值为0.4。 若质粒为低或中拷贝数的松弛型质粒，在培养液中添加2.5ml 34mg/ml 氯霉素（终浓度为170ug/ml），37℃ 200r/min再培养12~16h。 注：对于高拷贝数的质粒不需要添加氯霉素。 取部分菌液（1~2ml）到离心管中，4℃储存。4℃，2700g离心15min，收集余下的培养物。弃上清，倒置离心管使残余的上清流出。 用200ml冰预冷的STE重悬沉淀，4℃，2700g离心15min，收集细菌并贮存于-20℃。 用贮存的1~2ml 菌液提取质粒，采用酶切和琼脂糖电泳分析此小量制备质粒，以确定大量培养菌液中正确的质粒已得到扩增。 注：设置这种对照可能看上去有点过于谨慎，然而它可以避免发生某些可能难以挽回、浪费大量时间的错误。 将冻存的细菌沉淀室温放置5~10min使其解冻， 用18ml（10ml）溶液I重悬。 注：只有使用了氯霉素的菌液才应参照括号中的体积数。 加2ml （1ml）新配置的10mg/ml溶菌酶。 加40ml （20ml）溶液II，轻轻颠倒数次，彻底混匀，室温放置5~10min。 注：延长超螺旋DNA暴露于碱的时间会使其不可逆变性，所产生的环状卷曲DNA不能被限制酶内切，而且它在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率为正常超螺旋DNA的两倍，难以被溴化乙锭染色。 加20ml （15ml）冰预冷的溶液III，轻轻地、但完全地振荡混匀几次（此时应不再有分离的两个