农杆菌转化番茄(1).docVIP

农杆菌介导转化番茄 1．农杆菌感受态细胞的制备 1)挑取少许农杆菌GV3101的单菌落，接种于5 ml YEP液体培养基（含50 mg/L Rif）中，28 ℃下，200 rpm培养过夜，活化菌株。 2)取2 ml菌液于100mlYEP液体培养基（含50 mg/L Rif）中继续培养4h左右，直至OD600为0.4-0.6(一般需6-8h)。 3)培养物置冰浴中10 min，4 ℃下 5000 rpm离心5 min，弃去上清液。 4)用10 m预l冷的0.02M CaCl2悬浮菌液，冰浴静置10min。 5)4 ℃下，5000 rpm离心5min，弃去上清液。 6)用1 ml预冷的含10%甘油的CaCl2（20 mM）悬浮，分装成50 (或100) μl/管，液氮冷冻后至-80 ℃中保存或直接转化。 2．冻融法转化农杆菌 1)从超低温冰箱中取出农杆菌感受态，冰浴中融化后向加入2 μl载体质粒DNA，混匀后冰浴30 min。 2)液氮中冷冻1 min，37 ℃恒温水浴中热击5 min，然后立即冰浴2 min，该过程不要摇动离心管。 3)加入900-950 μl无抗生素的LB液体培养基，28 ℃下，200 rpm振荡培养3 h。 4)8000 rpm离心1 min，倒掉上清液，用100 μl LB回溶菌体。 5)取50 μl菌液涂到YEP固体培养基上(含有50 mg/L Kan+100 mg/L Rif)，28 ℃下倒置培养2~3 d。 6)挑取单菌落，28 ℃下，200 rpm振荡培养24h，用菌液PCR验证阳性克隆。 3．利用农杆菌介导转化番茄 3.1 农杆菌培养 吸取100μl上述阳性克隆菌液加入20 ml YEP液体培养基(含有100 mg/L Rif +50 mg/L Kan)中培养24 h(28 ℃，200 rpm)，活化菌株；取100 μl菌液接种至上述50 ml同样培养基中进行第二次培养(剩下的菌液可用于保菌)，28 ℃ 200 rpm培养16 h后收集菌液（4 ℃，4000 rpm离心20 min），用含有乙酰丁香酮（AS 40 mg/L）的MS培养液悬浮，28 ℃下活化1~2 h，然后稀释至OD值为0.2左右，用于转化试验。 3.2 番茄转化、再生体系的建立 1)将番茄种子置于灭菌后的组培瓶中（为保证其发芽率，用蒸馏水提前浸泡1夜），用75 %的乙醇浸泡1 min，倒掉乙醇，加无菌水冲洗2次，再用0.7 % NaClO（有效氯含量）消毒20 min，最后用无菌水冲洗5~6次。用消毒镊子将番茄种子均匀地摆于瓶中，每瓶约30粒，封好口后置培养箱中培养。 2)种子经过一周左右长出子叶，当两片子叶刚刚展开，而中间还未长出真叶时，用刀子切掉子叶两端，摆放在培养基上进行预培养。摆放时切口要接触培养基，暗培养2 d。（注：①每个子叶尽量只切接近叶柄部位一刀形成一个伤口为好；②尽量将离体的子叶叶片远轴端——即背面，完全接触培养基培养。实验操作中发现注意以上两方面有利于伤口愈伤的形成及后期的分化。） 3)将预培养后的子叶浸入摇好的农杆菌液中，轻摇，使子叶切口处尽量接触菌液，15~20 min左右取出，用滤纸吸干，排列在MS共培养基中，暗处共培养2 d。 4)共培养之后，不冲洗农杆菌，直接转入MS后培养基中（含Cef 350 mg/L）进行后培养，光下培养3 d。 5)转入MS分化培养基中（含Hyg 2 mg/L，Cef 350 mg/L），2周左右形成愈伤，分化出小苗，2周继代一次。 6)芽体长至2~3 cm时切下，移入MS生根培养基中，促其生根。待根系发育好后，移入盛有基质的花盆中，弱光下用塑料薄膜保湿一周后，移至温室常规管理。 试剂配制： 各过程培养基（PH值:5.6）： ①预、共培养基：MS(4.43 g/L)+IAA(0.5 mg/L)+6-BA(1 mg/L)+AS(40 mg/L)+MES(0.7 g/L)+葡萄糖(2 g/L)+蔗糖(30 g/L)+琼脂(7 g/L) ②悬浮培养基：MS(4.43 g/L)+AS(40 mg/L)+MES(0.7 g/L)+葡萄糖(2 g/L)+蔗糖(30 g/L) ③后培养基：MS(4.43 g/L)+IAA(0.1 mg/L)+ZT(2 mg/L)+AS(30 mg/L)+Cef(350 mg/L)+蔗糖(30 g/L) +琼脂(7 g/L) ④筛选培养基：MS(4.43 g/L)+IAA(0.1 mg/L)+ZT(2 mg/L)+Hyg(2 mg/L)+Cef(350 mg/L)+蔗糖(30 g/L) +琼脂(7 g/L) ⑤分化培养基：MS(4.43 g/L)+IAA(0.1 mg/L)+ZT(2 mg/L)+Cef(350 mg/L)+蔗