庞斌双的蛋白电泳和连接转化程序(1).doc

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术(SDS) 一、实验原理 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis），简称SDS电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）强还原剂，SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，使半胱氨酸之间的二硫键断裂，从而使蛋白质在一定浓度强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。 二、仪器和药品 1、仪器 垂直板电泳槽一套（玻璃板、板夹、夹条、加样梳），电泳仪，恒温水浴锅，恒温循环水浴锅，离心机，PH计，电子天平，漩涡混合器，样品钳，染色盘，漏斗，玻璃棒，10mL移液管，洗耳球，剪刀，餐巾纸，滤纸，橡皮膏，10μL、20μL 、200μL、1000μL微量移液枪，200mL、250mL、500mL、1000mL容量瓶，100mL、200mL、500mL、1000mL 烧杯，100mL、1000mL量筒，1.5mL离心管，试剂瓶（７个），卫生纸，PE手套，乳胶手套。 2、药品 异丙醇，丙烯酰胺（Acr）,甲叉双丙稀酰胺（Bis），三羟基胺基甲烷（Tris）,十二烷基硫酸钠（SDS）, 甘氨酸，二硫代苏糖醇（DTT）,甘油（Glycerol）, 溴酚蓝，过硫酸铵（APS），四甲基乙二胺（TEMED）,考马斯亮蓝R-250,盐酸，正丁醇，95%的乙醇，三氯乙酸，医用凡士林，三氯甲烷，Repel，盐酸。 三、试剂配制 1、样品提取液 (1)50%异丙醇 异丙醇:蒸馏水（V:V）＝1:1 (2)HMW-GS样品提取缓冲液母液(Sample Buffer) 4gSDS+11.5mL蒸馏水+20mL甘油+25mL 0.5M Tris(PH=6.8)+25mg溴酚蓝,60℃水浴溶解，4 HWM-GS样品提取液 取(2)中提取母液10mL +10mL 蒸馏水+200mgDTT，完全溶解，4℃ 2 胶溶液的配置 (1)40%丙烯酰胺(Acr)(注意：神经毒素，请在通风橱内称量！) 称200g Acr置于500mL烧杯中, 加入蒸馏水，60℃水浴溶解,待温度降至室温，将溶解的Acr液倒入500mL容量瓶中,用蒸馏水补至刻度线,过滤,4 (2) 2%甲叉双丙烯酰胺(Bis) (注意：神经毒素，请在通风橱内称量！) 称4g Bis于200mL烧杯中, 加入蒸馏水，60℃水浴溶解,待温度降至室温，倒入200mL容量瓶, 用蒸馏水补至刻度线,过滤,4 (3) 3M Tris-HCl(PH8.8) 称72.6gTris 置于200mL烧杯中,加蒸馏水至150mL，60℃水浴溶解, 待温度降至室温，加入8mL盐酸,再缓慢加入微量盐酸，调PH值至8.8，将调好后的Tris溶液倒入200mL容量瓶中,用蒸馏水调至刻度线,过滤，4 (4)0.5M Tris-HCl (PH6.8) 称15.1g Tris 置于500mL烧杯中,加蒸馏水溶解,用盐酸和酸度计调PH值至6.8。将调好的溶液倒入250mL容量瓶,蒸馏水调至刻度线,过滤，4℃ (5)10%十二烷基硫酸钠(SDS)(注意：有毒，通风橱内称量！) 10g SDS加90mL蒸馏水于100mL烧杯中，60℃ (6)10%过硫酸铵(APS) 3g APS加30mL蒸馏水于100mL烧杯中，分装到1.5mL离心管中，-20℃ 表1分离胶贮备液(Separation Gel)和浓缩胶贮备液(Stacking Gel)的配方 试剂名称 分离胶贮液 C=2.67 浓缩胶贮液 C=2.67 浓度 T=8% T=10% T=12% T=3.7% 40% Acr(mL) 8.72 10.95 13.14 1.824 2% Bis(mL) 4.75 6.0 7.21 1 Tris 3M PH8.8(mL) 5.64 5.67 5.66 Tris 0.5M PH6.8(mL) 5 ddH2O(mL) 25.2 21.7 18.3 12 10% SDS(μL) 500 500 500 200 10% APS(μL) 200 200 200 150 TEMED(μL) 20 20 20 20 总体积mL 45 45 0 （下面配方是做两块1mm厚、规格为16cm×18cm胶的用量） T=（WAcr+WBis）/ V胶总溶液×100%；C= WBis /（WAcr+WBis）×100