免疫共沉淀与Western Blot.pdf

免疫共沉淀与Western Blot 实验步骤: 1．以60mm 细胞培养皿为例，细胞转染后24 －36 小时后，吸净培养液 （可用PBS 小心漂洗一次）。 2 ．加入500μl 预冷的1×lysis buffer, 于4 ℃或冰上放置裂解细胞5 分钟。 3 ．将细胞裂解液转移到1.5 ml eppondorf 管内，于冷冻离心机4 ℃，13000 g 离心30 ， 分钟。 供 4 ．将离心后的上清液分为两份：一份35μl，加入等体积的2×SDS sample buffer, 混 提 匀后于100℃煮10 分钟，做为总细胞裂解液 （total cell lysate ，TCL ）于－20 ℃ 丝 保存，或取6 －10 μl 进行SDS－PAGE 电泳，Western blot 检测目的蛋白的表达 粉 水平 （接第5 步）。另一份用于免疫沉淀，具体操作如下： 1） 分A/G beads ：按每管（一个免疫沉淀样品）加入5 μl Agrose A/G beads 号 及5 μl （1 μg ）抗体计算一次实验所用beads 及抗体的总量，将抗体和beads 混 众 合，补充lysis buffer （补充的lysis buffer 的量能使每管能均匀分配到50 μl beads 公 及抗体的混合物），将beads 及抗体的混合物按每管50 μl （含5 μl beads 及5 μl 抗 信 体）分配到1.5 ml Eppendorf 管中，再加入400 μl 1×lysis buffer，备用； 微 用 2 ）从步骤4 中另一份用于免疫沉淀的上清液中取400 μl 加入到上一步（步骤 沿 自 1））已分好的beads 中，使终体积达到850 μl，将管子固定到混匀器上使混匀器 前 限 匀速旋转 （15 rpm）免疫沉淀3 小时； 最 仅 3 ） 将免疫沉淀后的溶液于4 ℃ 3000 rpm 离心3 分钟，去上清，加入 500μl 学 ， 1×lysis buffer 洗涤 beads ，于冷冻离心机4 ℃3000 rpm 离心3 分钟，弃上清，共 科 洗涤三次。 用 物 4 ）最后一次洗涤完毕，弃上清，管中只剩Beads ，加入35 μl 1×lysis buffer 与 商 等体积 2×SDS sample buffer 混合，于100℃煮沸10 分钟，稍离心后取10μl 左右 植 禁 上样到PAGE 胶，进行电泳，或－20 ℃冻存。 严 5 ．电泳完毕，取下P