分子生物学实验技术实验操作指南.docVIP

PAGE 1 《分子生物学实验技术 实验操作指南》 目录 TOC \o 1-3 \h \z \u 1 植物基因序列分析 3 2 引物设计的原则 4 3 试剂的配置和灭菌 5 4 植物基因组DNA的提取 6 5 DNA的定量 8 6 DNA的电泳 9 8 PCR产物的回收 12 9 PCR产物连接T载体和感受态细胞的转化 14 10 菌落（液）PCR 17 11 质粒DNA的提取 19 12 质粒DNA的酶切 21 1 植物基因序列分析 基因组DNA（genomic DNA, gDNA）：功能基因包括三个基本序列：5’上游区，转录区和3’下游区。 5’上游区和3’下游区：转录起始位点上游和转录终止位点下游的序列，主要起到基因表达调控作用。 转录区：转录起始位点和转录终止位点之间的序列，经核不均一RNA最终被加工为成熟的mRNA。 信使RNA（messenger RNA, mRNA）：由DNA的一条链作为模板转录而来的，携带遗传信息的能指导蛋白合成的一类单链核糖核酸。由编码区、上游的5’非编码区和下游3’非编码区组成，5’端带有7-甲基鸟苷-三磷酸帽子结构，3’端有多腺苷酸尾巴。 互补DNA（complementary DNA, cDNA）：具有与某m RNA链呈互补的 碱基序列的 单链DNA。 蛋白质编码区（sequence coding for amino acids in protein, CDS）：与蛋白质序列一一对应的DNA序列，且该序列中间不含其它非该蛋白质对应的序列。只有外显子，不含内含子。 5’非翻译区（5’-untranslated region, 5’UTR）：mRNA位于基因转录起始位点至编码区翻译起始密码子之间顺序。 3’非翻译区（3’-untranslated region, 3’UTR）：mRNA位于编码区翻译终止密码子下游一段不被翻译的序列。 2 引物设计的原则 引物长度：一般为20-25bp。若产物长度等于或小于500bp，可选用16-18bp的引物；若产物长达5kb，则需要用更长的引物。 加有酶切位点的引物可适当延长。 引物的特异性：最好在模板cDNA的保守区内设计，设计好后需要通过序列比对判别其特异性。 引物GC含量：GC含量在40%－60%之间，以45-55%为宜。 引物Tm：Tm值是DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度。引物所对应模板序列的Tm 值最好在72℃左右。至少要在55-80℃之间。 Tm=2(A+T)+4(C+G) 引物序列随机性：ATGC最好随机分布，避免5个以上嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 引物自身：不能含有很长的牢固的自身互补序列，尤其是引物3‘端回折形成的发夹一不要般超过3bp。 引物之间：两个引物之间不应有很长的牢固的互补或同源碱基，尤应避免3’端的互补重叠。 引物3’端：引物3’末端和模板的碱基完全配对； 防止发夹结构和二聚体形成。 引物的5′端：引物的5′端可以修饰，加酶切位点、标记生物素、荧光、地高辛等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列。 3 试剂的配置和灭菌 试剂的配置： 利用电子天平称取固体试剂或者量筒（或移液器）量取液体试剂溶于适量的溶剂。 如需调整pH值，需要pH计的测定下用酸或碱滴定至目标pH。 试剂配置的原则是先配置浓度高的各组分溶液，然后再将各组分溶液混合获得各种缓冲溶液和试剂的贮存液，灭菌后低温保存，需要时再稀释到工作液浓度使用。 试剂和耗材的高压蒸汽灭菌： 在高温高压条件下，利用湿热使细菌、真菌、芽孢、孢子等微生物的蛋白变性，进而死亡达到灭菌的效果。主要适用于耐高温、高压，不怕潮湿的试剂与耗材。 准备：向高压蒸汽灭菌锅内加水至水位标记线，将准备灭菌的试剂及耗材用牛皮纸包好，装入锅内套层中（物品放置不宜过多，锅内应留出一定空间）；然后拧紧锅盖。 加热：加热，当压力表上升到所需压力时（一般为100KPa/121℃），灭菌15-30min。 结束：待压力表降至“0”时，打开锅盖，取出灭菌物品。 注意事项：严格遵照操作规程，防止意外事故发生；易燃，易爆物品禁用高压蒸气灭菌；瓶装液体灭菌时，应留有适当排气出口，灭菌结束后再密闭；耗材灭菌结束后最好烘干。 试剂的过滤灭菌： 采用过滤法除去微生物，适合于对热不稳定的试剂。将待过滤溶液吸入注射器，通过压力使溶液经过过滤器（内含孔径为0.22-0.45μm的过滤膜）进入无菌容器。 4 植物基因组DNA的提取 一、实验目的： 去除蛋白质、RNA等高分子物质，去除多糖、多酚等次生物质，获得高品质的植物基因组DNA，可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、文库构建、Southe