酶活测定方法(1).doc

测定方法： 硝酸还原酶（NR）测定： 试剂： a．1μg/ml 的NaNO2标准液：0.9857g定溶到1 L，再吸取5ml定容到1L． b．0.1mol/L PH 7.5 的磷酸缓冲液：Na2HPO4·12H2O 30.0905g +·2H2O 2.4965g 定溶到1 L. c．1% 磺胺溶液：1 g磺胺溶于100ml 3 mol/L 的 HCl中（25ml CHl定溶到100ml） d．0.02% 萘基乙烯胺溶液： 0.02g 萘基乙烯胺定溶于100ml, 贮于棕色瓶． e．0.1mol/L的KNO3溶液： 2.5275g KNO3溶于250ml 0.1mol/L PH7.5 的磷酸缓冲液中． f．0.025 mol/L PH 8.7 的磷酸缓冲液：．Na2HPO4·12H2O 8.8640g + K2HPO4·3H2O 0.0570g 定溶到1 L. g．提取缓冲液： 0.1211g 半胱氨酸、0.0372gEDTA溶于100ml． h．2 mg/L 的NADH溶液： 0.1g NADH溶于50ml 0.1mol/L PH7.5 的磷酸缓冲液中(临用前配制)． 步骤： 标线制作： 试剂/ ml 管 号 1 2 3 4 5 6 7 NaNO2标准液 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 蒸馏水/ml 2.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0 1% 磺胺溶液 4 4 4 4 4 4 4 0.02% 萘基乙烯胺溶液 4 4 4 4 4 4 4 每管含亚硝态氮/μg 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 酶液提取：0.5g 鲜样剪碎于低温冰箱冰冻30min，取出置于冰浴＋4 ml 提取液研磨匀浆，4℃ 酶液0.4 ＋ 1.2 ml 0.1mol/L的KNO3溶液 + 0.4ml NADH溶液，混匀，25℃保温30min，对照不加 保温结束后立即加入1ml的磺胺溶液中止反应，再加1ml萘基乙烯胺溶液，显色15min后于4000 r/min 离心5min，去上清在540nm下比色。 计算： 单位鲜重样品硝酸还原酶活性＝(x / V2)*V1 / (w * t) x -----亚硝态氮总量，μg；V1――――－提取液总量，ml；V2――――－反应液中加入的粗酶量，ml；w-------鲜重，g；t------反应时间，h． NOS测定： 提取液：0.1mol/L PH 7.5 的磷酸缓冲液 ＋ 3.2 mM 蔗糖 ＋ 5 mM DTT 0.5 g 鲜样 ＋ 4ml提取液，研磨匀浆，10000 r/min 离心 15 min，上清液即为酶粗提液。 按NOS试剂盒方法测定 H2O2测定： 提取液：50mM的磷酸钾缓冲液，PH6.5 0.5 g 鲜样，液氮磨碎＋ 4ml提取液，研磨匀浆，10000 r/min 离心 20 1ml上清+0.1ml 0.5%的硫酸钛（用20%硫酸配）+0.2ml浓氨水，10000转离心10 min, 用丙酮洗涤两次 沉淀溶解在2.5ml的6 M的硫酸中（可以加大硫酸的量，确保沉淀都能溶解） 标线制作： 试剂/ ml 管 号 1 2 3 4 5 6 7 100 uM/L H2O2 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 提取液/ml 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 硫酸钛 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 浓氨水 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 每管含 H2O2/μg 0 10 20 40 60 80 100 Re: linzhifang. 1988, 衰老叶片和叶绿体中H2O2的积累与膜脂过氧化的关系。植物生理学报，14(1): 16-22. O2－测定： 提取液：65 mM PH 7.8 的磷酸缓冲液 1 g 鲜样 ＋ 3ml提取液，研磨匀浆，10000 r/min 离心 15 min，上清液即为酶粗提液。 1ml 上清液 ＋ 0.9ml PBS ＋ 0.1ml 10mM 羟胺氯化物（0.695g盐酸羟胺定溶于1L），25℃ 取1ml培养液 ＋ 1ml 17mM对氨基苯磺酸（2.944g对氨基苯磺酸定溶于1L）＋ 1ml 7mM α－萘胺（1.002g定溶于1L），25℃ 反应后显色液用同体积的正丁醇充分摇匀，1800g离心5min，吸出粉红色水相测A530 计算：按同样程序作NO2－的标线，将A530换算成[NO2－]，然后根据下列方程式计算： NH2