酵母双杂实验方法总结.docxVIP

双杂文库的建立和筛选由四个主要步骤组成， 第一步是建立一种pGADT7 DNA-BD融合载体； 第二步是建立cDNA文库； 第三步是建立一个GAL4 AD融合文库（载体为pGADT7-T）； 第四步是筛选双杂文库（酵母融合与共转化）。 酵母菌株 酵母菌株的保存 未转化菌株在含有25%甘油的YPD培养基中，于—70C°保存一年， 转化菌株在含有25%甘油的合适的SD缺失培养基中保存，以保持菌株质粒的选择性，（SD缺失培养基依据质粒选择），—70C°保存一年， 划线于YPD或合适的SD缺失培养基上的菌株在4C°储存时间＜2月。 酵母菌株的活化 用一小部分冻存菌株划线于YPDA或SD平板，30C°温育3天，至克隆长到2 mm，将平板在4 C°保存1-2月，作为工作平板使用。 挑取单克隆接种于YPDA或SD培养基中，30 C°250rpm过夜培养。 酵母基因的克隆 挑取单克隆于液体培养基中，30°C，250rpm培养过夜 10000rpm，离心2min，去上清。 0.2%SDS，200μl重悬菌液，95°C，温育15min，离心，取上清液作为PCR模板。 在PCR管中依次加入以下试剂，混匀 Reaction Component per rxn ddH2O 19.5 μl 10×Advantage 2 PCR Buffer 2.5 μl 50×dNTP Mix 0.5 μl T7SP Primer 0.5μl 3 AD Primer 0.5μl 50×Advantage 2 Polymerase Mix 0.5μl PCR模板 1μl Total Volume(μl) 25 μl 轻拍混匀各组分，稍稍离心后放到PCR仪。 按下面程序开始PCR： 94℃ 3min 35 cycles： 94℃ 30sec 55℃ 30sec 72℃ 2min 72℃ 5min 从各管中分别取5ul电泳，检测。 酵母菌株感受态的制备 从-80C°冰箱中取出酵母菌株，在YPDA固体培养基上划线，30 C°培养36h可见单克隆。 重复划线一次，待长出单克隆，用封口膜密封，作为工作平板，可于4 C°保存一个月。 从YPDA平板上挑取单克隆，接种于20ml的YPDA液体培养基中，于30 C°220rpm培养（每瓶接种3-4个克隆）。约16h后，测OD为0.5OD6001.0。（通常第一天下午15:00挑取克隆生长至第二天8:00收集菌体）。 取10ml菌液收集于50ml离心管中，室温下2200 rpm离心5 min。 弃掉上清液（缓慢倾斜倒出），用600 μl的0.1M的LiAc重悬菌体，混匀，30 C°孵育30 min。（此时可以开始准备转化所用的MIX） 室温2200 rpm离心5 min，弃掉上清。 用200 μl的0.1M的LiAc重悬菌体，每50 μl分装至1个1.5 ml的离心管，作为感受态置于冰上待用。 酵母细胞的转化 移取大约50 μl Herring DNA到一个离心管中，100°C加热15 min。然后立即放在冰上冷却DNA。（该步骤可于感受态细胞制备步骤5同时进行）。 取一个无菌的离心管置于冰上，按下表顺序从上到下加入各组分配制N倍体积的MIX， Components Volume(μl) 40%PEG4000 300 1M LiAc 36 Salmon sperm DN A(10mg/ml) 5 H2O 5 Total 346 向每管感受态细胞中加入346μl的MIX，混匀。 向上述离心管中分别加入2μl（200ng）的质粒，包括正对照、负对照、以及各个测试质粒，混匀。 将混合物在30 C°孵育30min ， 42 C°孵育40-60min，迅速插入冰上冷却2min， 室温12000rpm离心1min，用枪头吸取上清， 用400μl无菌水重悬细胞， 用枪头吸取100-200μl菌液涂SD平板（平板类型依 据所转化质粒的营养缺陷性决定，30C°倒置培养48h后可见单克隆。 酵母双杂载体 克隆载体 pGBKT7 DNA-BD：被用于表达一种诱饵蛋白与GAL4 DNA结合结构域(BD)融合的蛋白。 pGADT7 AD：被用于表达一种文库cDNA与GAL4 激活结构域(AD)融合的蛋