酵母双杂最终版.docxVIP

Prey质粒与Bait质粒共转AH109（用于点对点） 实验步骤： （1）AH109，-80℃冰箱，蘸取少许菌液划线于YPDA固体培养基上，30℃倒置培养2-4天； （2）挑 1mm 克隆（2-3个）接种于1ml YPDA液体培养基中，用枪仔细吹打，使菌分开，将其转移至50mlYPDA液体培养基，30℃振荡培养20小时(过夜)，OD600达到1.2左右； （3）转移30ml菌液接入300ml(体积视转化个数确定,一般50ml菌液可以做10个转化)YPDA中培养4小时左右，使培养液OD600在0.4-0.6； （4）将50ml菌液转入离心管中， 700g，5分钟室温离心收集菌体，弃上清； （5）20ml ddH2O重悬菌体(一定要轻)，700g，5分钟离心收集菌体，弃上清； （6）重复步骤5一次； （7）20ml 1×TE/LiAc重悬菌体，700g，5分钟离心收集菌体，弃上清； （8）重复步骤7一次, 用1.5ml 1×TE/LiAc重悬后即为酵母感受态细胞,100μl分装；1×TE/LiAc配制：TE（10×TE）:LiAc（1M，pH 7.5）:H2O=1:1:8 （9）各加入600μl TE/LiAc / PEG，再加入50μl预变性的*Carrier DNA （2mg/ml）, 每种质粒都加入约1μg(经验为2μl)，剧烈振荡（提高转化效率），30°C恒温，200rpm 振荡培养30min;每加一种物质都混匀一下再加下一种物； TE/LiAc / PEG配制: TE（10×TE）: LiAc（1M，pH 7.5）: 50% PEG=1:1:8 * Sperm DNA 新配制时水浴煮沸20分钟，立即插入冰浴，保存于-20°C。建议每次使用时都变性复性一次，冰浴备用。 （10）各加入70μl DMSO，缓缓倒置混匀(不能振荡)，42°C水浴热休克20min，每10min上下颠倒混匀一次，迅速插入冰浴冷却5min； 700g，5分钟离心收集菌体，弃上清； ddH2O洗涤一次菌体。 （13）利用残余液体重悬菌体，涂布于SD/-Trp/-Leu平板上。 （14）30℃培养箱培养。第2天即可观察到克隆长出，第3天克隆即长到所需大小。 注：一般情况下，两个蛋白如果有互作的，在2-3天后长出的菌落一般显白色或者浅粉红色。而没有互作的两个蛋白，长出的菌落则显红色。 （15）挑一个菌落（点一下就行），点入200μl H2O,混匀，点5μl菌于SD/-Trp-Leu-His固体平板上，超净台中放干后再封膜，倒置培养3-5天即可看到结果，将阳性克隆再点于SD/-Trp-Leu-His-Ade平板上（三缺上有可能是假阳性），最终确定结果。// (15) 挑单克隆于Leu-Trp二缺液体培养基中培养至OD600 =1.0,取5ul点菌于SD/-Trp-Leu-His/3-AT/X-α-Gal和SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT/X-α-Gal固体平板中。一般2-3天就可看到结果，最好观察到第5天再确定最终结果，以免漏掉那些相互作用比较弱的蛋白。 一般采用膜检的方法，检测LacZ基因的表达情况。膜检方法如下: 1) 将阳性克隆菌落影印于滤纸上。 2) 将滤纸完全浸于液氮中，时间长于30秒，取出后晾干。 培养皿加入适量显色液* (新鲜配制)，垫一层滤纸，让其完全湿润，将冻溶 后的滤纸铺在上面，使显色液渗透到表层。9cm培养皿加2ml 显色液，15cm培养皿加5ml 显色液。 盖上皿盖，放置在37℃培养箱中，避光放置 20分钟后开始观察有无变蓝的阳性结果并记录，一般以3小时为准，特殊情况下可以看过夜是否变蓝。 6)反应过后打开皿盖，将滤纸烘干，保存并记录。 显色液: 100ml Z buffer,0.27ml β–mercaptoethanol,1.67ml X-gal Z buffer: 16.1g/L Na2HPO4·7H20, 5.50g/L NaH2PO4·H2O, 0.75g/L KCl, 0.246g/L MgSO4·7H2O,pH7.0。室温可以存放一年。 X-gal: X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indoly-β-D-galactopyranoside)溶于DMF (N,N-dimethylformamide)中，终浓度为20mg/ml。 试剂准备 Carrier DNA: Herring Testes Carrier DNA,Denatured. Clontech. 10mg/ml. 未使用过的Carrier DNA 先100℃变性10分钟，立即置于冰浴2分钟,然后再100℃变性10分钟，之后置于冰浴上备用。已经使用过的Carrier DNA只需要 1×TE/LiAc: V10×TE