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基因工程的原理和技术讲解 第二节 基因工程的原理和技术 一、教学目标： 1.了解基因工程的基本原理。 2.描述重组DNA技术的基本步骤。 二、教学重点、难点： 基因工程的基本原理和基本操作步骤。 一、基因工程的原理和操作步骤： 原理：让人们感兴趣的基因（目的基因）在宿主细胞中稳定和高效表达。 ①目的基因的获取； ②形成重组DNA分子； ③重组DNA 导入受体细胞； ④筛选含有目的基因的受体细胞； ⑤目的基因表达。 二、基因工程操作步骤： 1.第一步：目的基因的获取 （1）方法： ①从基因文库中获取目的基因 ②利用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增目的基因（目的基因的序列已知） ③化学方法合成目的基因（目的基因的序列已知） ①从基因文库中获取目的基因 用限制酶切成许多片断 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入受体菌的群体储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。 ②利用PCR技术扩增目的基因 聚合酶链式反应，在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。可以获得大量的目的基因。 循环 变性 退火 延伸 目的基因的扩增呈指数形式扩增（2n） 人工合成基因的方法 反转录法 根据已知的氨基酸序列合成DNA ③化学方法合成目的基因 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 结构基因的核苷酸序列 推测 推测 目的基因 化学合成 双链DNA (即目的基因) 反转录 合成 目的基因的mRNA 单链DNA(cDNA) ③化学方法合成目的基因 通过化学合成的目的基因是否含有粘性末端？ 2、形成重组DNA分子 —— 核心 质粒 DNA分子 限制酶处理 两个切口 获得目的基因 DNA连接酶 重组DNA分子（重组质粒） 同一种 一个切口 两个粘性末端 3、将重组DNA导入受体细胞 转化 常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。 将目的基因导入受体细胞的原理 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。 （1）将重组DNA导入植物细胞 农杆菌转化法 基因枪法 （2）将重组DNA导入动物细胞 显微注射技术 提纯基因表达载体 体外显微注射入受精卵 受精卵移植 1.将重组DNA导入植物细胞 农杆菌转化法 基因枪法 2.将重组DNA导入动物细胞 显微注射技术（最多、最有效） 3.将重组DNA导入微生物细胞 Ca2+处理，以增加细菌细胞壁的通透性。 抗氨苄青霉素基因 α点为目的基因与 质粒A的结合点 　　目前把重组质粒导入细菌细胞时，效率还不高，导入完成后得到的细菌，实际上有的根本没有导入质粒，有的导入的是普通质粒A，只有少数导入的是重组质粒。 四环素抗性基因 怎样筛选出已经导入质粒的细胞？ 4.筛选含有目的基因的受体细胞 抗氨苄青霉素基因 α点为目的基因与 质粒A的结合点 四环素抗性基因 在此基础上，怎样鉴别已导入重组质粒的细胞？ 抗氨苄青霉素基因 α点为目的基因与 质粒A的结合点 四环素抗性基因 图a示基因工程中经常选用的载体——pBR322质粒，Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因。目的基因如果插入四环素抗性基因中，将使该基因失活，而不再具有相应的抗性。 a b Ampr Tetr c 再将灭菌绒布按到图b的培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布平移按到含四环素的培养基上培养，得到如图c的结果（空圈表示与b对照无菌落的位置）。 为了检查载体是否导入原本没有Ampr 和Tetr的大肠杆菌，将大肠杆菌培养在含氨苄青霉素的培养基上，得到如图b的结果（黑点表示菌落）。 4.筛选含有目的基因的受体细胞 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记： －－－如以质粒做为载体可进行抗性的检测 原理：质粒上有抗生素的抗性基因 方法：利用选择培养基筛选 ①检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因（关键） ②检测目的基因是否转录出了mRNA ③检测目的基因是否翻译成蛋白质（表达） （2）常用的技术： ①DNA分子杂交技术 ②蛋白质分子（抗原－抗体）间的杂交 5. 目的基因的表达 （1）内容： （2）基因工程的的原理及技术 分子水平：DNA分子杂交技术 核心－－DNA探针 目的基因的脱氧核苷酸（单链）序列片段 用荧光分子或放射性同位素标记 看能否形成杂合的双链区 检测— 鉴定—— ①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 ②检测目的基因是否转录出了mRNA ③检测目的基因是否翻译成蛋白质 抗虫鉴定、抗病鉴定等 过程:A.首先取出转基因生物的基因组DNA B.用含目的基因的DNA片段( 单链)用放射性同位素等作标记, 以此做探针 C.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带, 表明目的基因已插入染色体DNA中