第六章基因在原核及真核体系中的表达.pptVIP

第六章 基因在原核及真核体系中的表达 第一节 真核基因在大肠杆菌中的表达 DNA? Protein 一、真核基因在大肠杆菌中的表达 1、理论上的困难: 遗传机制的差异 基因结构、 mRNA结构、转录信号（SD）、细菌蛋白酶、蛋白的后加工 cDNA、使用原核启动子及SD序列、引入突变体 2、克隆基因表达的基本条件 启动子、SD、正确插入方向 3、增强外源蛋白稳定性的途径 1977-化学合成脑激素的表达 形成融合蛋白（? -内啡肽-? -半乳糖苷酶）以胰蛋白酶切割-适合链内不含Met的蛋白 低蛋白酶活性突变体 T4 phage的pin基因 二、原核生物的表达载体 1、Lac 启动子的表达载体 阻遏作用区、CAP作用区、RNA聚合酶作用区 2、Trp启动子的表达载体 trp启动子、操纵基因、前导序列 3、PL启动子的表达载体 CI的温敏突变（CI857)-阻遏蛋白在42? C 失活 三、高等真核基因在大肠杆菌中表达的实例 1、胰岛素基因在大肠杆菌中的表达 化学合成A、B链，分别融合? -半乳糖苷酶，得到? -gal-A和? -gal-B，活性低 胰岛素原基因的克隆及表达，体外切割祛除C肽 2、生长激素 四、提高克隆基因表达效率的途径 1、启动子的结构对表达效率的影响 -35 TTGACA -10 TATAAT 合成启动子tacI(11 Lac) tacII(8Lac) -35与-10间17bp最高活性 启动子最佳距离的探测 目的基因 E E 启动子 A 酶切开 Bal31酶解 A E E 目的基因 2、转译起始序列对表达效率的影响 转译起始的保守序列： AUG、SD(UAAGGAGGU的部分或全部）、核糖体的结合位点有一个或几个终止密码子、含全部或部分PuPuUUUPuPu 其他： SD后的4碱基4 A或4T（GC则25%-50%）、起始密码子左边UAU、CUU最好，UUC UCA AGG 下降20倍 3、启动子同克隆基因间距离对表达效率的影响 4、质粒拷贝数对表达效率的影响 5、转录终止区对克隆基因表达效率的影响 终止区存在的必要性： 转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因本身的转录效率下降； 如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性； 过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗； 更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率 终止子 强终止的选择与使用 目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的Tf。对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用 终止子也可以象启动子那样，通过特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因组DNA中克隆筛选 pCP1 Apr ori Tcr 筛选Apr、Tcs的转化子 6 、质粒分离的不稳定性对效率的影响 质粒分配由par控制 克隆该基因 保持选择压力 反选择：质粒含CI， 宿主是溶源化细菌，其噬菌体启动子缺陷 7、密码子的使用频率(bias) 复习提纲 1、真核基因在大肠杆菌中的表达存在的问题及其解决办法。 2、真核克隆基因在大肠杆菌中表达的基本条件。 3、增强外源蛋白在大肠杆菌中表达稳定性的途径。 4、提高克隆基因在大肠杆菌中表达效率的途径。 第二节 哺乳动物基因工程 一、哺乳动物基因转移的遗传选择标记 嘌呤和嘧啶代谢 1、嘌呤和嘧啶的生物合成-全程途径和补救途径 2、胸腺激酶（thymidine kinase tk）基因选择系统 胸苷? 胸苷一磷酸 （1）tk-细胞 建立tk-细胞系方法：取代法 5-溴尿嘧啶脱氧核苷（BudR）TK+?胸腺嘧啶?掺入DNA链?致死 （2）HAT选择法 次黄嘌呤(Hypoanthine) 氨基蝶呤(Aminopterin) 胸苷(Thymidine) ? 　　　 二氢叶酸还原酶　←（受氨基蝶呤抑制） 二氢叶酸(培养基中成分) －－－/－－→四氢叶酸 　 ↓ +dGTP(培养基中成分) 次黄嘌呤 －－－－－－－－－－－－→ dATP+dCTP (细胞生存 胸苷激酶（TK） 胸苷 －－－－－－－－－－－－－→ TTP