蛋白表达纯化20110419.pptVIP

蛋白表达纯蛋白表达流程 序列分析 表构建达载体 蛋白表达 蛋白纯化 蛋白检测 原核表达 非融合型表达载体 融合型表达载体 -- 带标签的表达载体（His 、GST） 具有编码不同多肽的标签序列，为定位、检测或纯化目的蛋白提供方便。 若蛋白较小可加入融合标签，促进蛋白正确折叠。 -- 分泌型表达载体 可使外源基因产物直接分泌到大肠杆菌的外周腔，减少在胞内表达且表达产物 对细菌的毒性，同时外周腔中的蛋白酶活性低，有助于提高融合蛋白的稳定性。 原核生物表达系统 优势：遗传背景清楚、表达量高、产物易纯化、使用范围广。 劣势：原核表达系统翻译后修饰体系不完善，表达产物活性低。 原核表达 目的基因的获取 选择载体、构建重组表达质粒 转化受体菌 重组体的筛选鉴定 I 重组表达载体克隆 1. 目的基因获取： 基因组DNA、mRNA反转录cDNA、人工合成 2. 常用载体 ： His标签： pET系列（pET28a、pET32a）、pQE系列 GST标签：pGEX系列 3. 构建重组质粒： 选择合适的内切酶位点、酶切、连接 4. 转化感受态细胞： 热击法转化非表达型感受态菌 5. 重组体的鉴定： 阳性抗药克隆菌落PCR 阳性抗药克隆提质粒、酶切鉴定 测序 原核表达 转化表达菌株 优化诱导条件 表达蛋白检测 放大培养 I I 蛋白诱导表达 1. 表达菌株选择：（pET系统） 常规表达菌株：BL21 表达毒性蛋白：BL21pLys 适合表达真核基因：Rosseta（BL21衍生菌，补充大肠杆菌缺少的6种稀有密码子） 2. 诱导表达 pET系统采用T7启动子，诱导剂：IPTG 诱导要素：IPTG浓度、诱导温度、诱导时间 设置阴性对照：未加IPTG诱导 3. SDS、WB检测，确定目的蛋白 未诱导、诱导后的全菌、诱导后上清、诱导后沉淀 包涵体表达及增加蛋白可溶性 优化诱导条件，增加蛋白溶解性 在 E.coli中表达的重组蛋白经常以不溶的、无活性蛋白聚集体的形式表达，被称作包涵体。即使在形成包涵体时，还是有一部分目的蛋白是溶解的。由于pET 系统的高表达水平，即使有大量的目的蛋白聚集形成包涵体，也会有相当多的可溶性目的蛋白存在。在通常情况下，降低蛋白合成速率，如降低诱导培养温度及在基本培养基中生长都会使目的蛋白的可溶性增加。 诱导和培养条件：37℃（包涵体）， 30℃，低温(15-20℃)诱导过夜， IPTG浓度，诱导后的培养条件 细胞周质定位：选择带有信号肽的载体（pET12/20/22） 宿主菌：尝试可表达真核蛋白的Rosseta菌株 裂解缓冲液：普通的Binding buffer中一些疏水或膜结构蛋白会是不溶的，但如果加入非离子去污剂就会变成可溶。 表达载体选择 标签选择： 6XHis： -- 适合任何表达系统 -- 纯化后不需切割标签 -- 纯化简单，也可纯化包涵体蛋白 -- 小标签对重组蛋白折叠影响小 GST：谷胱甘肽巯基转移酶 -- 适合任何表达系统 -- 相对可增加蛋白的可溶性 -- 纯化后需切除标签 -- 标签蛋白可能会形成二聚体 标签蛋白 ： 优点 -- 可以提高蛋白的可溶性和稳定性。 -- 用亲和层析的方法对蛋白进行纯化， 采用通用的检测标签的方法。 缺点 -- 标签可能对蛋白的结构、折叠和生物学活性有影响。 -- 切除标签时，酶切效率不会达到100%，会有氨基酸残余。 His标签： pET系列 常规表达载体：pET28a、pET32a、pQE系列 周质腔表达载体： CBD融合(pET36/37)、Dsb融合(pET39/40) 采用带pelB/ompT引导肽的载体(pET12/20/22) 采用带MBD融合(pMAL载体, Biolabs) 、SUMO融合 GST标签：pGEX系列 pET-28a 蛋白纯化 蛋白纯化 方法 -- 亲和层析 -- 凝胶过滤 -- 离子交换层析 亲和层析—通过生物分子之间特异性的相互作用来分离物质的方法。 配体—受体 抗原—抗体 底物—酶 常用的亲和配基 配基 目标蛋白 洗脱条件 其他 Ni2+ 组氨酸标签(His) 咪唑 载体：pET 谷胱甘肽 谷胱甘肽巯基转移酶(GST) 还原型谷胱甘肽 载体: pGEX 直链淀粉 麦芽糖结合蛋白（MBP） 麦芽糖 载体：pMAL，具有MBP信号序列进行