菠萝蛋白酶粗提液的凝胶过滤层析.pptVIP

菠萝蛋白酶粗提液的凝胶过滤层析;一、实验目的;二、实验原理;常用术语 固定相 流动相 床体积，Vt 洗脱体积，Ve 外水体积，Vo 内水体积，Vi 基质体积，Vg;凝胶过滤 利用具有一定孔径的多孔凝胶作为固定相，把分子大小不同的物质分离开的层析技术，又称为分子筛。;凝胶的类型有葡聚糖凝胶（商品名为Sephadex）、聚丙烯 酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等。 葡聚糖凝胶用得最多，它是α-1，6葡聚糖与1-氯-2，3- 环氧丙烷反应交联而成的 ，有不同型号的凝胶。 ; 凝胶的吸水能力与凝胶的交联度关系密切。 G表示交联度，G后面的数字是凝胶吸水量（ml/g干胶）乘以10所得的值。;三．实验设备: 层析柱(2x20cm)、恒流泵、自动部分收集器、水浴锅、751-紫外分光光度计;四．实验试剂 1、Sephadex G75（葡聚糖G75） 2、柱层析试剂∶0.1M PBS 3000 ml pH7.8 3、测酶活试剂： （1）1%酪蛋白300 ml ： （2）激活剂 300 ml ： （3）5%TCA（三氯乙酸）400 ml 4、酶液浓缩 （1）用实验一的透析袋。 （2）PEG（聚乙二醇）6000 ;五．实验步骤;柱的选择 ;装柱;加样;总的实验流程;A280数值高的管进行酶活测定：按下表进行，其中，以一管作为对照。 ↓ 把酶活及蛋白含量高的收集管的溶液混在一起，到入干净的透析袋，用聚乙二醇吸水，直到酶液浓缩到2～3mL，用吸管把酶取出，留到下次电泳实验用。 ↓ 把Sephadex G75倒到烧杯中 ↓ 清洗干净层析柱、部分收集器、恒流泵的塑料管;试剂;酶活单位：在上述条件下(37℃,酶促反应10min)，每10min增加0.01个光吸收值的酶量为一个酶活力单位（U）。;实验结果;六．实验结果分析