分子生物学实验2幻灯片.ppt

* 产物分析区管理制度 实验人员进入该室须穿专用红色工作服，实验中应需戴手套，手套须常更换。 使用本室专用的经灭菌处理的加样器和带滤芯的吸头。 实验记录使用本室专用记录本和笔。 使用过的离心管、吸头须置于1％次氯酸钠溶液中浸泡，消毒后方可丢弃。 PCR产物分析区的物品不得带出本室，严防污染携带至前区。 实验完毕后要打开紫外灯消毒，最好通夜消毒。 * 定量PCR概念 以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，对PCR起始模板量的定量 * 常规PCR与定量PCR的比较 * 实时荧光定量PCR原理 指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累实时监测PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。 Ct（cycle threshold)值定义：每个反应管的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。 荧光阈值（threshold)的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即： threshold=10×SD cycle0-15 * Ct值与起始模板的关系 每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始模板数越多，Ct值越小，利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，只要获得未知样品的Ct值，及可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 * 荧光定量的标准曲线 标准曲线 未知标本 Crossing Point (Cycles) log (copy number) n log (F2/F1) n log (F2/F1) Target 38 * 除常规的一对引物以外，PCR反应体系中另加有一个能与PCR产物杂交的荧光双标记探针。该探针的5端标记一个荧光基团，3标记另一个荧光基团。此时5端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3’端荧光淬灭基团（发生FRET），因此正常情况下检测不到该探针5端荧光基团发出的荧光信号。 Taqman探针原理 * 但当溶液中有模板时，模板变性后低温退火时，引物与探针同时与模板结合。在引物的介导下，沿模板向前延伸至探针结合处，发生链的置换；  Taqman探针原理 * Taqman探针原理 Taq酶的5—3’外切酶活性将探针5端连接的荧光基团从探针上切割下来，游离于反应体系中，从而脱离3’端荧光淬灭基团的屏蔽，接受光刺激发出荧光，切割的荧光基团数与PCR产物的数量成比例。因此根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。 * 实时荧光定量PCR无需内标 Ct值的重现性:同一模板Ct值恒定. Ct值与起始模板的线性关系决定. 内标对实时荧光定量PCR有影响:加入内标后PCR反应变成双重PCR,存在竞争。无法加入合适的起始拷贝的内标。 * 定量PCR在临床诊断治疗上的意义 对致病微生物核酸含量进行定量检测 弥补免疫检测的缺陷（如HCV） 缩短诊断的窗口期（如HBV,HIV） 对治疗过程进行药物疗效监测指导用药 加快疾病的诊断，病情判断预后 对染色体突变导致的遗传病进行检测 * 定量PCR在乙肝检测中意义 1. 判断疾病的严重程度和传染性 2. PCR结果与血清免疫学结果的综合评价 3. 观察抗病毒药物疗效，指导药物用量 4. 献血员窗口期病毒核酸的筛查及早期诊断 5. 预测病情、判断预后 6. 器官移植、母婴垂直传播 * * * * * HBV DNA 定量检测能提前做出预后判断 目前指标： 1.?????? e抗原阴转 2.?????? HBV 病毒载量小于104拷贝/ml 3.?????? ALT正常 4.?????? e抗体由阴转阳 * LightCycler 7 分子生物学实验 * 一、实验目的 1、熟悉乙肝病毒DNA提取方法 2、掌握乙肝病毒DNAPCR检测方法 * 二、实验原理 聚合酶链反应（PCR）技术是在体外模拟体内DNA复制，利用两段特异的寡核酸引物，由DNA聚合酶催化产生目的基因的扩增技术。 * PCR技术基本原理 * 目的基因扩增 循环数. 扩增子数 (靶序列拷贝数) 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1,048,576 30 1,073,741,824(10亿) 1 循环= 2 扩增子 2 循环 = 4 扩增子 3 循环 = 8 扩增子 4 循环 = 16 扩增子 5 循环 = 32 扩增子 6 循环 = 64 扩增子 7 循环 = 128 扩增子 * 三、实验准备 （一）试剂 1、DNA提取液 2、PCR反应液 3、石蜡油、双蒸水 4、电泳缓冲液（TAE） 5、2％琼酯糖 6、溴化乙锭（EB） 7、Taq聚合酶 10XPCR缓冲液 dNTP 引物 * 三、实验准备 （一）器材和仪器 1、离心机 2、水浴锅 3、PCR扩增仪 4、电泳