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基因工程的载体和工具酶 2010-03-29 16:37:05来源：易生物实验 浏览次数：2679网友评论0条 第一节载体一、质粒载体（一）质粒的生物学特性（二）质粒DNA的制备（三）质粒载体的改造二、 噬菌体载体（一）1噬菌体载体（二）M13噬菌体（三）柯斯质粒载体 第二节基因操作的工具酶一、限制性核酸内切酶及其应用（一）限制性核酸内切酶的发现（二）限 制性核酸内切酶的分类（三）限制性核酸内切酶的命名（四）11型限制性核酸内切酶的基木特性（五） 限制性核酸内切酶的消化反应二、DNA连接酶及其应用（一）DNA连接酶的发现（二）DNA连接酶 作用特点（三）DNA连接酶的反应条件（四）T4 DNA连接酶对目的DNA片段和载体连接的一般方案三、 DNA聚合酶及其应用 关键词：基因工程载体工具质粒载体噬菌体载体DM连接酶DM聚合酶工具酶限制性核酸内切酶 第一节载体 引言 基因克隆的本质是使目的基因在特定的条件下得到扩增和表达，而忖的基因本身无法进行复 制和表达、不易进入受体细胞、不能稳定维持，所以就必须借助于“载体”及其“寄主细胞” 來实现。 作为基因克隆的载体必须具备以下特性： ⑴载体必须是复制子。 ⑵具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选。 ⑶具备多克降位点（MCS）,便于外源基因插入。 ⑷自身分子量较小，拷贝数高。 ⑸在侶主细胞内稳定性高。 一、质粒载体 （一）质粒的生物学特性 （1） 质粒是独立于染色体以外的能自主复制的裸露的双链环状（少数为线形和RNA） DNA 分子。 广泛从在于细菌细胞中，比病毒更简单。在霉菌、蓝藻、酵母和一些动植物细胞中也发现了 质粒，li前对细菌的质粒研究得比较深入，特别是大肠杆菌的质粒。大肠杆菌的质粒主要有 F质粒（F因子）、R质粒（抗药性因子）和Col质粒（大肠杆菌素因子）三种。 （2） 质粒的大小差异很大，最小的只有1kb,只能编码中等大小的2?3种蛋白质分子，最大的 达到200kbo 质粒的生存在寄主细胞中“友好”地“借居”，离开了寄主它本身无法复制；同吋质 粒往往有宿主专一性，如大肠杆菌的复制起点不一定能在其它生物细胞屮繁殖。 质粒的复制类型一-种质粒在宿主细胞屮存在的数目称为该质粒的拷贝数。据拷贝数将 质粒分为两种复制型：“严紧型”质粒(stigent plasmid),拷贝数为“松弛型”质粒(r elaxed plasmid),拷贝数为10-60。不过即使是同一质粒，英拷贝数在不同的寄主细胞间和 不同的生长环境也可能有很人的变化。 质粒的不亲和性两种亲缘关系密切的不同质粒不能在同一宿主细胞屮稳定共存。载 体质粒与受体的质粒应是不同的不亲和群。 ⑹质粒的转移 转移性质粒，含有存m基因；能通过结合作用从一个细胞转移到另一个细胞。 非转移性质粒，不含/阳基因；可以为转移性质粒所带动转移。 (7)质粒的存在形式有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种， 质粒DNA的制备 有多种分离质粒的方法，如碱裂解法、煮沸裂解法、层析柱过滤法等。 目前一般使用碱变性法制备质粒DNA。这个方法主要包括培养收集细菌菌体，裂解细胞， 将质粒DNA与染色体DNA分开及除去蛋白质和RNAo 1?碱变性法质粒提取的原理： 根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出來 的。 在pH值12.0-12.5范围内时，线性的DNA会被变性而共价闭合坏状质粒DNA却不会被变 性。 通过冷却或恢复中性pH值使之复性，线性染色体形成网状结构，而cccDNA可以准确迅速 复性，通过离心去除线性染色体，获得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质 粒 DNAo 2 ?碱变性法提取质粒的步骤： 取1.5毫升含质粒的大肠杆菌过夜培养物，加在微量离心管中，离心收集细胞沉淀； 加入 100微升冰冷的溶液 I, (50mM 葡萄糖,25mM Tris-HCI PH=8.0, 10mM EDT A)涡旋震荡悬浮菌液。 加入200微升新配制的溶液II, (0.2M NaOH, 1.0%SDS)缓缓混匀置室温5分钟。 加入150毫升冰冷的溶液川,(醋酸钾29.4克,冰乙酸11.5毫升,加蒸馅水至100毫升) 颠倒离心管10次后，冰浴5分钟。 （5）离心的上清液用苯酚抽提数次，用乙醇沉淀收集质粒DNA。 （三）质粒载体的改造 ⑴去掉不必要的DNA区段。 ⑵减少限制酶的识别位点，一种酶只保留一个。（单一的限制性酶切位点）。 ⑶加入易于捡出的选择性标记基因。 ⑷对质粒进行安全性改造，要求质粒不能随便转移。 ⑸改造或增加基因表达的调控序列。 1、 质粒 pBR322 结构： （1） 氨节青霉素抗性基因Campr或Apr） 内部有3种限制酶单一识别位点。 （2） 四环素抗性基因（⑹r或7dr） 内部有7种，启动区内有2种限制酶