病原微生物原位杂交检测法实验综述.docVIP

PAGE PAGE 1 病原微生物原位杂交检测法实验综述 　　摘要原位杂交法近年来广泛用于生物和医学领域，其实验技术有很强的应用价值。阐述了病原微生物原位杂交检测法的实验地位和作用、实验课的设计思路和实验内容。 　　关键词病原微生物；原位杂交；地高辛标记；实验综述 　　中图分类号R446.6文献标识码A文章编号1007-5739（2013）09-0335-01 　　根据安庆师范学院生命科学学院课程设置情况，微生物学是主干基础学科，且学校注重学生实践技能的培养。结合生命科学前沿动态，病原微生物关系到居民生活和健康，是近年来的研究的热点。以地高辛标记的原位杂交技术，在医学、免疫学和基因组学等领域发展十分迅速，以应用性为导向，制定了该实验方案。 　　1实验原理 　　1.1病原微生物 　　病原微生物是指侵入机体后引起感染的病原体。常见的病原微生物有大肠杆菌、沙门氏菌和单增李斯特菌等。 　　1.2原位核酸分子杂交技术 　　简称原位杂交技术。可将特定的基因或者核酸序列直接定位在染色体上，其灵敏度和敏感性高，不用提取组织核酸而且不受细胞中其他成分影响，较好地保存了细胞结构和形态。可用于外源DNA的鉴定，本实验用于定性和定位病原微生物。将细胞经适当处理后，其通透性增加，用标记好的序列已知的核苷酸单链作为探针，进入细胞，根据碱基互补配对的原则，与组织或细胞中待检测的核酸序列，发生特异性结合，形成杂合体。选择与标记物对应的检测系统，使用荧光检测或者化学显色的方法，杂交体在细胞原位形成带有颜色的杂交信号[1]。 　　1.3随机引物法地高辛标记探针原理 　　以DNA单链为模板，合成双链的过程中，用同位素标记4种核苷酸底物中有1种，则在与模板序列配对的许多位置，会形成放射性探针；若用DIG-11-dUTP代替dTTP，则产生地高辛标记的探针。标记的探针DNA的平均长度越长，引物的浓度越低[2]。 　　1.4探针的选择 　　用于原位杂交的探针有RNA、ssDNA和dsDNA。如用于检测RNA样品，称为Northern杂交；如用于检测DNA样品，称为Southern杂交。根据病原微生物种类选择合适的探针，可根据探针来源和性质分为DNA探针、cDNA探针、RNA探针及人工合成的寡聚核苷酸探针等[3]。探针长度一般在100～400个碱基，寡聚核苷酸探针（16～30个碱基），短核苷酸探针能自由出入细菌细胞壁，杂交效率比长探针高。 　　1.5标记物的选择 　　标记物可以是放射性同位素，也可以是非放射性生物素和半抗原等。但因同位素对人体伤害较大，近年多选取非放射性物质进行标记。本文选用地高辛标记系统[4]。 　　2实验内容 　　2.1实验课的目的 　　了解检测病原微生物的常用方法；掌握原位杂交实验原理和操作方法；了解原位杂交技术的应用。 　　2.2实验材料 　　供试菌株为单增李斯特氏菌；供试试剂为地高辛标记及检测试剂盒；U-NIQ-10柱式总RNA抽提试剂盒；DNA胶回收试剂盒。 　　2.3实验步骤 　　2.3.1核酸探针的制备。引物设计合成：根据单增李斯特氏菌的保守区域，设计1对引物，即P1：5′-ACAATTCATCTAGTGCGT-3′；P2：5′-CCACCTATACCAGTTGAC-3′。 　　2.3.2RT-PCR扩增上述保守区域。按UNIQ-10柱式总RNA抽提试剂盒说明，抽提单增李斯特氏菌总RNA，采用一步法RT-PCR进行扩增。琼脂糖凝胶电泳检测后，按UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒说明回收DNA片段。 　　2.3.3地高辛标记该基因片段。模板DNA浓度：取回收获的DNA片段，用Nanodrop超微量核酸蛋白测定仪，测核酸浓度。10ng/μg模板DNA用双蒸水补足至16μL。双链DNA变性成单链：98℃加热10min，迅速冰浴冷却。取4μLDiG-highPrimer与变性后DNA充分混匀，并离心。37℃温育过夜。终止反应：加2μL0.2moL/LEDTA（pH值8.0）或65℃加热10min。 　　2.3.4探针标记效率与灵敏度测定。将对照DNA和标记好的探针分别按试剂盒说明进行稀释后，点样于硝酸纤维膜上，按试剂盒说明进行显色。 　　2.3.5点样。将单增李斯特氏菌的菌液滴在硝酸纤维膜上进行点样。 　　2.3.6细胞的固定。用4%多聚甲醛室温下固定2h单增李斯特氏菌，用1×PBS漂洗3次，每次5min，梯度乙醇脱水，每级5min。用2张滤纸包住膜，置于真空干燥箱中，80℃固定2h。 　　2.3.7蛋白酶K消化。在单增李斯特氏菌细胞涂片上覆盖1层10mg/L的蛋白酶K溶液，37℃消化10min，PBS漂洗3次，每次5min，然后放入4%多聚甲醛后固定5min，PBS漂洗2次，每次5min，2×SSC漂洗2次，每次5min，100%乙醇脱