最新聚合酶链反应及基因突变检测方法培训课件.pptVIP

一、逆转录PCR（RT-PCR） 以细胞内总RNA或mRNA为材料进行体外扩增的技术。 主要用于克隆 cDNA、合成cDNA探针，检测RNA病毒、分析基因表达等 逆转录生成cDNA方式： 以随机进行的PCR扩增所需的下游引物作为逆转录反应的引物 以oligo(dT)作为引物， mRNA3`末端polyA尾与之互补 以人工合成的随机序列六核苷酸混合物作为引物，进行扩增 二、定量PCR 对DNA或RNA样本的靶序列进行定量分析。 主要用于基因表达的分析、病原体核酸的检测等 在定量PCR反应体系中，除了常规PCR反应所需的材料和试剂外，还必须引入内参照系统。 内参照系统一般选用与待测序列结构无关的基因常用的内参照基因是?-肌球蛋白基因 绝对定量 PCR 外参照系统的设置 内参照系统的设置 实时定量 PCR 对核酸扩增反应进行直接和动态的监测， 实现对靶基因的实时定量分析 荧光定量PCR（fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR），又称实时PCR，是目前较精确的进行定量检测PCR的方法 FQ-PCR通过荧光信号对PCR过程中产物量进行实时监测，精确计算出PCR的初始模板量 荧光信号的检测方法： 1、DNA结合染料技术 2、水解探针技术（TaqMan probe）技术 3、杂交探针技术 TaqManTM 5’ 5’ 3’ 3’ d.NTPs Thermal Stable DNA Polymerase Primers 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ Add Master Mix and Sample Denaturation 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ Annealing Reaction Tube Taq l 5’ 3’ R Q Probe 5’ 3’ R Q 5’ 3’ 5’ 3’ TaqManTM Extension Step 5’ 3’ 1. Strand Displacement Taq 3’ Q R 5’ 5’ 3’ 3’ Q Taq R 5’ 2. Cleavage 3. Polymerization Complete 5’ 3’ Q Taq R 3’ 5’ 4. Detection 5’ 3’ 3’ Q Taq R 5’ l R 5’ 3’ R Q 实时定量RT-PCR检测CEA基因拷贝数在监测胃肠癌微转移中的应用 CEA 基因在消化系统上皮腺癌， 尤其是直结肠癌和胃癌中高表达， 因此在肿瘤细胞内可检测到其转 录本，而在正常成人体内极少表 达。 正常成人体内CEA基因表达 胃肠癌肿瘤组织中CEA基因的表达 在肿瘤发生血道转移时，外周血 中有少量肿瘤细胞残留。用灵敏、 特异的技术检测到这些肿瘤细胞 中CEA基因的转录本，是发现肿 瘤早期转移的关键。 胃肠癌患者外周血中CEA基因的表达 三、多重PCR 在同一反应体系中加入多对引物，同时扩增一份DNA样本中多个不同序列的靶片段。 DMD基因外显子缺失的检测 四、差异显示PCR（differential display PCR,DD-PCR） 一种以逆转录PCR为基础的研究基因表达差异的技术。 DD-PCR主要用于肿瘤和多种疾病的分子遗传学研究，是目前筛选基因表达差异最有效的方法。 差异显示RT-PCR(Differential display RT-PCR) 聚合酶链反应及基因突变检测方法 上海交通大学医学院 刘湘帆 讲师 聚合酶链式反应于1983年由美国Cetus公司的K.Mullis建立，并和定点突变的发明者M.Smith一起荣获1993年度诺贝尔化学奖，为生命科学领域的研究开创了崭新时代。 PCR反应的特点 特异性强 引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性 灵敏度高 指数增长，从pg (10-12)可扩增至 mg (10-6)水平 简便、快速 2～4 小时完成扩增 对标本的纯度要求低 DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板 一、PCR反应原理和反应过程 DNA的体外复制包括3个步骤： 变性（denaturation）:94 ?C ~95 ?C 退火（annealing）:40 ?C ~70 ?C 延伸（extension）:72 ?C 3个步骤作为PCR的一个循环，每当完成一个循环，一个分子的模板被复制为二个，产物量以指数形式增长。 PCR原理 5’ 5’ 3’ 3’ d.NTPs 耐热DNA聚合酶 引物 5’ 3’ 5’ 3’ 5’