河北农大生物化学第一章核酸化学.ppt

（三）脱氧核糖核酸酶 1．牛胰脱氧核糖核酸酶 （pancreatic deoxyribonuclease简称DNase I） 2．牛脾脱氧核糖核酸酶 （spleen deoxyribonuclease, 简称DNase II） 3．限制性内切酶（restriction endonuclease） 简称限制酶 （１）作用： 限制性内切酶主要降解外源的未经特殊修饰的DNA，对自身起了保护作用。 （２）限制性内切酶的特征 ① 具有严格的碱基专一性，有专一的识别顺序、切点 ② 粘性未端，平整末端 （3）限制性内切酶举例 （四）非专一性核酸酶类（nonspecific nuclease） 介绍二种外切酶 1．蛇毒磷酸二酯酶（venom phosphodiesterase） 5?-核苷酸 2．牛脾磷酸二酯酶 对末端磷酸基的要求与蛇毒磷酸二酯酶相反 + 3′-核苷酸 （五）磷酸单酯酶 将单核苷酸或寡核苷酸末端的磷酸单酯键切开，得到磷酸和其它产物 1．特异性磷酸单酯酶 2．非特异性磷酸单酯酶 磷酸基无论在3′或5′位，都能水解，如E. Coli磷酸单酯酶 （1） 磷酸基连在5′位才能水解，如牛精液5′-核苷酸酶 （2） 磷酸基连在3′位才能水解，如麦芽3′一核苷酸酶  酸水解： 　　　酸性条件下DNA和RNA都不稳定(糖苷键和磷酸酯键都易被酸水解) 。 　　　在强酸和高温下，如用12N高氯酸和100°C条件下，可以把DNA和RNA完全水解成各种嘌呤、嘧啶和戊糖等基本成分，但高氯酸对胸腺嘧啶有破坏 ，使回收率偏低。高浓度的甲酸也可以把DNA和RNA完全水解成各种嘌呤、嘧啶和戊糖等基本成分，但尿嘧啶回收率偏低。 碱水解 　　　在稀碱条件下（PH11）RNA很容易被水解，生成2′-核苷酸和3′-核苷酸。 DNA在同样碱性条件下，甚至：PH13时，DNA虽已变性，但仍不被水解，因为没有2′- OH，不能形成碱水解的中间产物。 第五节 核酸的分离提取和纯化 核酸分离纯化的一般原则 核酸分离纯化的主要步骤和方法 核酸的纯度鉴定和保存 （一）核酸的分离、提取通则 为了得到完整的大分子核酸，一般要注意3点 : 1．保持低温（0o～4℃）。 2．防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌。 3．防止核酸酶的作用。 抑制DNase： 可加柠檬酸钠、EDTA等金属螯合剂；或加去污剂 十二烷基硫酸钠（SDS）；或加蛋白变性剂。 抑制RNase： （1）实验器皿高温，或高压灭菌，不能高压灭菌的用具用0.1%二乙基焦碳酸盐（diethyl pyrocarbonate, DEPC）处理。 （2）加强的蛋白变性剂如硫氰酸胍、异硫氰酸胍等。 （3）加核糖核酸酶阻抑蛋白（RNasin）等RNase的抑制剂。 纯DNA 生物材料 DNP（RNP） DNP 纤维状DNA 较纯DNA *原核生物的DNA是裸露的，与蛋白质结合不多，分离纯化要简单些。 破细胞 溶解于1.0mol/L NaCl* 蛋白质变性剂去蛋白质 酒精沉淀 去RNA 柱层析，电泳 密度梯度离心 去多糖 （二）大分子DNA的提取 （三）RNA的提取 （1）稀碱法 （2）浓盐法 （四）核酸纯度鉴定 1.A260/A280 2.电泳 （五）核酸含量的测定 1.定磷法（钼蓝比色法） 2.定糖法（比色法） 3.紫外吸收法 （六）凝胶电泳 核酸研究中最常用的方法 优点：简单、快速、灵敏、成本低。 通过凝胶电泳 （1）可进行核酸分离，知道核酸的纯度。 （2）测定分子大小。 （3）估计核酸的构象。 凝胶电泳兼有分子筛效应和电荷效应 1．琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis） 琼脂糖凝胶电泳的迁移率主要与分子大小、胶浓度、核酸构象、电流等有关。 2．聚丙烯酰胺凝胶电泳 （polyacrylamide gel electrophoresis） 用于分析RNA或Mr小于1000bp的DNA片段 适用于大分子核酸，一般用于DNA分析。 HGP取得的成就 ? 完成了人类基因组工作草图绘制,揭示了人类基因组若干细节 ? 基本上测定了人类基因组上的碱基序列 ? 一些模式生物(果蝇、拟南介等)和作物（如水稻）基因草图绘制成功，测序基本完成 ? 促进了生物信息学、蛋白质组学、糖组学的迅猛发展 ? 人类基因组草图绘就，中国科学家功不可没 HGP面临的挑战 ? 基因的隐私权问题 ? 基因组图谱和