概述2.2 DNA提取及检测.ppt

Relaxed supercoiled Increasing degree of supercoiling 相同分子量的DNA: 闭合环状卷曲超螺旋迁移最快， 线性分子次之， 伸展开环状最慢。 琼脂糖凝胶电泳 1. 琼脂糖 2. 琼脂糖凝胶 琼脂糖在水里（或电泳液）中加热到沸点后溶解，冷却后又凝固成均匀的的胶体“胨”。 是一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物琼脂中提取而来。 琼脂糖的浓度决定凝胶的空隙（密度）。浓度高,空隙小 3.低熔点胶(LMP) 熔点为62-65℃,可在37℃下保持液体状态数小时,25℃下保持10分钟. 低熔点琼脂糖回收DNA 直接进行酶切处理 4. 电泳所用溶液 TBE(5Χ)缓冲液:Tris-Base,硼酸,EDTA-Na2 加样缓冲液:溴酚蓝,蔗糖水溶液 EB是扁平分子，能插入DNA碱基之间，但不与琼脂糖结合。 EB在300nm紫外光照射下能发红色荧光，即可显示DNA泳带在凝胶中所处的位置。 荧光强度与DNA含量及大小成正比。 2) 原理 Ethidium bromide（EB） 1) 染料 溴化乙锭 5. 凝胶染色 UVP全自动凝胶成像分析系统 OMEGA8-LOGO全自动凝胶成像分析系统 优点是比琼脂糖凝胶的分辨率高的多。实用于蛋白质分离分析及DNA序列测定 聚丙烯酰胺凝胶浓度（%） 分离DNA片断大小（bp） 4.0 10.0 20.0 1000—100 500—25 50—1 聚丙烯酰胺凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳：200——50000bp 聚丙烯酰胺凝胶电泳：1——1000bp Marker Chapter 2 基因工程概述 DNA分子的提取与检测技术 工具酶和基因载体 基因工程的基本技术 Contents of chapter 2 第一节 基因工程概述 2.1.1基因工程的概念 人类按照自身的意愿，进行严密的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，有目的地改造生物种性，使现有的物种在较短时间内趋于完善，创造出更符合人们需求的新的生物类型。 基因工程模式图 A生物 a B生物 B生物 a 供体 目的基因 受体 转基因生物 A和B可以是不同种的生物，也可以是同一种生物的不同个体 基因分离 基因转移 基因表达 如果B生物是植物，称为植物基因工程。 如果B生物是动物，称为动物基因工程。 2.1.2基因工程的理论基础 基因工程技术是建立在分子生物学和分子遗传学理论发展基础之上的技术： 不同基因具有相同的物质基础 基因是可切割和转移的 多肽与基因之间存在对应关系，并且有着相同的遗传密码 基因的遗传信息是可以遗传的 基因的结构特点 基因: 产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核苷酸序列,由结构基因和调节基因组成. 结构基因: 转录成各种RNA直接行使功能;转录成 mRNA,翻译成功能蛋白质. 调节基因: 调节或限制其他基因活性的基因,如启动子, 增强子,终止子等. 2.1.2基因工程的理论基础 原核生物基因结构特点 DNA 1) 结构简练 2) 存在转录单元 3) 有重叠基因 mRNA 1) 半衰期短 2) 以多顺反子形式存在 3) 存在SD序列(SD序列（Shine-Dalgarnosequence）：mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列。SD序列在细菌mRNA起始密码子AUG上游10个碱基左右处，有一段富含嘌呤的碱基序列，能与细菌16SrRNA3’端识别，帮助从起始AUG处开始翻译。) 真核生物基因结构特点 DNA 1) 不连续性 2) 高度重复序列---卫星DNA mRNA 1) 5′帽子结构 2) 具ploy(A)尾 3) 单顺反子 基因工程的操作过程：切、接、贴、检查修复 ● 在供体细胞中用限制性内切酶切割基因 ● 把获得的目的基因与制备好的运载体用DNA连接 酶连接组成重组体 ● 把重组体进入宿主细胞 ● 筛选、鉴定出含有外源目的基因的菌体或个体 2.1.3基因工程的主要内容 2.1.4基因工程的意义 改变受体的某些性状 动、植物、微生物育种 量的改变：多和少的改变 多变少，少变多 质的改变：有和无的改变 有变无，无变有 1、基因转移不受种的限制 2、可以定向改变某一性状 A 直接和间接 获得人类所需要的某些物质 获得基因的直接产物 蛋白质 获得基因的间接产物 蛋白质和其它 1、可以获得大量、高纯度天然物质 2、可以获得自然界不存在的物质 A At A链：21氨基酸 B链：30氨基酸 2