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实验室常用试验方法 总RNA的提取（Trizol法提取〉 在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存， 则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于?80°C冷冻柜。在制备RNA时， 将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以 先行解冻，以避免RNase的作用。 1. 提取组织RNA时，每50?lOOmg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10 X106个细胞加1 ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞； 2. 将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15?30C下放置5分钟; 3. 在上述EP管中，按照每lml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15°C?30°C）放置2?3分钟后,12000g （2°C~8°C）离心 15 分钟； 4. 取上层水相置于新EP管中,按照每lml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙 醇，在室温下（15°C?30°C）放置10分钟,12000g （2°C?8°C）离心10分钟; 5. 弃上清，按照每lml TRIZOL加1 ml 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2°C~8°C）离心5分钟，弃上清； 6. 让沉淀的RNA在室温下自然干燥； 7. 用 Rnase-free water 溶解 RNA 沉淀。 PCR 实验室常用DM 聚合酶有三种：TaKaRa TaqTM, TaKaRa EXTaqTM和 PyrobestTM DNA Polymeraseo TaKaRa TaqTM 是一般的 DNA 聚合酶，保真性较差，但价钱便宜，一般用于基因表达的检测等。TaKaRa EXTaqTM是具有Proof reading活性的耐热性DNA聚合酶，具有一定的保真性，而且其扩增得到的PCR产物3端附有一个“A”碱基，如果希望直接将产物克隆到T-vector可以用此酶。PyrobestTM DNAPolymerase也是具有Proof reading活性的耐热性DNA聚合酶，其特点是保真性极高，扩增得到的PCR产物为平滑末端。如果进行基因的扩增请使用此酶。 1. 按下列组成在PCR反应管中调制反应液： TaKaRa TaqTM 或 TaKaRa EXTaqTM 的配方 Reagent Quantity, for 50)li 1 of reaction mixture 10X PCR buffer (Mg2+ free) 5 |il MgC12 (25mM) 如 TaKaRa TaqTM 力口 3 卩 1 如 TaKaRa EXTaqTM 加 4 卩 1 2.5mM dNTP mix 4 pl  10|iM Pr imer 上游 1 |il 10pM Pr imer 下游 1 pl Template DNA 1 I Taq 或 EXTaqDNA Polymerase 0. 25 pl Sterile deionized water Up to 50|il Tota I 50 (il /SampIe PyrobestTM DNA Polymerase 的配方 Reagent Quantity, for 50|nl of reaction mixture 1 OX Pyrobest buffer 5|il 2.5mM dNTP mix 4)il 10|iM Pr imer 上游  10|iM Pr imer 下游 1)il Template DNA 1 pl PyrobestTM DNA PoIymerase 0. 25p l Sterile deionized water Up to 50p1 Tota I 50|i 1 /Samp 1 e ① 反应总体积根据实际情况进行调控，可以做20~50卩1以节约试剂；② 将上表各成分加入到0.2ml或0.5ml灭菌的PCR薄壁管中； ③ 如果不用PCR仪的加热盖，在反应混合液的上层加30~50卩1的矿物油防止 样品在PCR的过程中蒸发： 2. 按以下程序进行PCR扩增。 PCR反应条件视模板、引物等的结构条件不同而各异，在实际操作中需根据 具体的情况以及P C R结果而进行优化。 Step Temperature, °C Time, min Number of cycles Note 起始 变性 94 ?95 1-3 1  变性 94 ?95 0.5-2 25-35 退火温度比理论退 火温度大概低5°C, 再根据反应结果优 化 退火 37-70 0.5-2 延伸 70-75 根据扩增产物 的大小 每分钟延伸lOOObp 最终 延伸 70-75 10 1