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吉塞拉系列砧木组培快繁体系研究方案 1. 试验材料 1.1试验材料 试验材料为市农业科学研究院试验园的樱桃矮化砧木Gisela5号、Gisela6号和Gisela12号砧木，以其无病虫害、生长健壮的新梢茎尖或带腋芽茎段（半木质化新梢和未木质化嫩梢）为外植体。 1.2试验时间 于2018年2月~2018年12月在市农业科学研究院院内大棚和市农业科学研究院生物技术研究所组培室进行。 2. 试验方法 2.1 主要试剂 K2SO4、MgSO4·7H2O、NH4NO3、KH2PO4、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、H3BO3、Na2MoO4·2H2O、Na2-EDTA、FeSO4·7H2O、Ca(NO3)2·4H2O、CaCl2·2H2O、烟酸（Vpp）、盐酸硫胺素（VB1）、盐酸吡哆醇（VB6）、肌醇、甘氨酸、ZT、NAA、琼脂、蔗糖、NaOH、无水乙醇、升汞、洗涤剂、75％酒精、1mol/L盐酸、6-BA、IBA、NAA、ZT、活性炭、 2.2 主要仪器 镊子、剪刀、组培瓶、容量瓶、玻璃棒、烧杯、量筒、天平、称量纸、广口瓶、丝口瓶、pH试纸、微波炉、锅、移液器、筐子、烘箱、超净工作台、盆子、网袋、酒精灯、培养皿、滤纸、计时器、打火机、一次性手套、乳胶手套、一次性口罩、实验服、洗瓶、 2.3初代培养 1.芽体消毒和预处理：取材前15天左右，整树喷施多菌灵一次，选取芽体无病虫害、生长健壮的半木质化带腋芽茎段或新梢，用透气纸袋包裹好备用。 2.在晴天剪取供试材料，去除大叶，用洗洁精刷洗一遍，浸泡30 min，清水冲洗30min，晾干。 3.将枝条剪成3~5 cm的茎段，装入组培瓶，在超净工作台上用75%酒精浸泡30 s，无菌水冲洗3次，每次1min。 4.用0.1% HgCl2消毒6-9 min，无菌水冲洗5-6次，每次1min。 5.用无菌滤纸吸干水分，剪成1~2 cm左右的下斜上平的带芽茎段或带几个较小叶片的茎尖，接种于初代培养基上，在光照条件下进行培养。 培养条件：WPM为基础培养基，加入ZT 1.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L，培养条件为24±2℃，2000 lx，12 h/天 观测指标：分别记录不同发育程度茎段的污染率、愈伤组织形成时间、愈伤组织形成率、芽体萌发时间、萌芽率、新枝生长速度等。 2.3.1消毒剂处理时间对外植体的影响 用0.1％HgCl2进行5、7、9、11 min4个处理。每瓶接种2个外植体，每处理接种10瓶，重复3次。30d时分别统计污染率、存活率、褐化率。 2.3.2初代培养基的筛选 分别以MS和WPM为基本培养基，筛选出适合樱桃矮化砧木Gisela的培养基。每处理每瓶接种3个，每次10瓶，重复3次，30d时观察芽的萌动情况，统计诱导率、增殖数。（在初代培养过程中，以WPM为基本培养基效果要好，MS培养基效果要差很多。在生根培养过程中，MS培养基和WPM培养基效果基本一样，MS养基对种子萌发及幼苗生长WPM培养基好一些。） 表1 初代培养基激素配比 培养基编号 培养基及其激素配比 M1 MS+6-BA0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L M2 MS+ZT1.0 mg/L+NAA0.1 mg/L M3 MS+6-BA0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L W1 WPM+ZT1.0 mg/L+NAA0.1 mg/L W2 WPM+6-BA0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L W3 WPM+ZT1.0 mg/L+IBA0.2 mg/L 2.3.3取材时间对培养效果的影响 外植体的取材时间也是组织培养能否成功的关键因素之一，分别在3、4、5、6、7、8、9、10各个月的中旬取外植体，选取生长势强，无病虫害的一年生枝条新梢的顶部，用0.1％的HgCl2消毒8min后，剪成长1.5 cm左右的茎段，接种在2.3.2所选培养基配方。每处理 各接种30个外植体，重复3次，培养20d时统计外植体诱导率、污染率、褐化率。 2.4继代培养 初代外植体培养30 d左右，待分化成苗后，将初代培养获得的嫩梢切下，接种在增殖培养基上。进一步探索6-BA与IBA、ZT与NAA不同的组合对Gisela增殖的影响，每处理10瓶，每瓶接种3个嫩梢，重复3次，30d时统计结果，分别统计增殖率、株高和生长状况。并作统计分析，以其确定最佳的继代培养配方。以上培养基均以MS、WPM为基础培养基，附加白砂糖30 g/L、琼脂6 g/L、pH值6.0，培养温度为24±2℃，光照强为2000 lx，12 h/天。 表2 继代培养基激素配比 培养基编号 ZT（mg/L） NAA（mg/L） W1 0.5 0.05 W2 0.5 0.1 W3 0.5 0.2 W4 1.0 0.05 W5 1.0 0.1