实验二 免疫组织化学技术.pptVIP

免疫病理学技术在科研及临床中的运用 免疫病理学 一、免疫细胞化学 一、免疫细胞化学 1、定义：利用已知抗体检测细胞爬片上细胞是否存在相应的抗原。 2、原理：抗体+细胞抗原----显色 3、运用：检测相关基因的表达 二、免疫组织化学Immunohistochemistry, IHC 原 理 用 途 试剂配置 操作步骤 免疫组织化学技术定义和原理 用 途 临床病理诊断：肿瘤分类诊断 上皮来源：CK，EMA 间叶来源：Vimentin 淋巴组织: LCA 科研：组织抗原表达情况 试剂准备 结果分析和判断 （1）判断原则 （2）对照设计 （3）非特异染色 （4）失败的原因及其处置方法 （1）判断原则 必须设立染色对照：阴性对照，阳性对照 抗原表达必须在特定部位：胞膜、核、浆 尽量避开出血、坏死及切片刀痕和界面边缘细胞的阳性表达 对免疫组化标记结果的意义不能绝对化 CK—胞浆阳性 （2）对照设计 阳性对照：已知阳性表达的组织 自身对照：同一标本中不同组织对照 阴性对照： A、阴性组织对照：已知阴性表达的组织 B、阴性试剂对照：空白对照 （3）非特异性染色 （3）非特异性染色 （4）染色失败的原因及处理方法 试验片：- 阳性对照片：- 阴性对照片：- 空白对照片：- 切片染色深或整张切片出现染色 抗体浓度过高 切片显色时间过长 组织没有正确封闭 冲洗不够充分 切片出现非特异性背景染色 内源性过氧化物酶、内源性生物素过多 血清封闭时间过短 抗体不纯 组织片内出血或坏死成分 冲洗不彻底 三、免疫荧光及免疫酶标 双重或多重免疫荧光标记染色 双重或多重免疫酶标记染色 双重或多重免疫酶标记染色 抗 体 ABC法：ABC代表的是亲和素－生物素－过氧化物酶复合物。利用抗生物素分别连接生物素标记的第二抗和生物素标记的酶。但是此法注意内源性生物素活性的消除，以减少非特异性的染色。SP法：是采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的碱性磷酸酶及底物色素混合液来测定细胞或组织中的抗原。PA是一种金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质，它能与各种动物的IGG的FC段结合，在免疫组化中可作为桥抗体或标记抗体。最大的优点是不受种属的特异性限制。此法还具有染色时间短、灵敏度高、背景染色淡等优点，分子量小，易于穿透组织。两者本质的区别是：SABC法的“三抗”是SABC复合物即链酶亲和素－生物素－过氧化物酶复合物；而SP法的“三抗”是过氧化物酶直接与链酶亲和素相连的，没有通过生物素的中介连接。SABC步骤：切片常规脱蜡、脱水；30％H2O2＋蒸馏水10份混合，室温5－10分钟以灭活内源性酶，蒸馏水洗；将切片浸入0.01M枸橼酸盐（PH6.0），微波炉加热至沸腾后断电，间隔10分钟，反复两次进行热修复抗原；滴加5％BSA封闭液，室温20分钟；滴加一抗，37℃1小时30分钟孵育；滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，室温下20分钟，PBS（PH7.2－7.6）洗；滴加试剂SABC，室温下20分钟，PBS洗5分钟×4次；DAB显色：取1ml蒸馏水，加试剂盒中A，B，C试剂各1滴，混匀后加至切片，室温显色18分钟；苏木素轻度复染；脱水，透明封片。显微镜下观察。 高压修复 pH=6.0柠檬酸盐缓冲液 大火加热直至沸腾；将脱蜡水化后的组织切片置于不锈钢或耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中。 盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷汽，从喷汽开始计时，1-2分钟后 胰酶消化抗原修复 于试管中加入一滴的胰酶浓缩剂和三滴稀释剂（1：3），均匀混合。 在组织切片上滴加100μl（两滴）混匀的酶试剂。 37．C孵育15-20分钟。 阴性对照切片-，阳性对照标本和待检测切片呈弱阳性 原因： 标本固定不当 抗体试剂问题：浓度、效价低 抗原修复不当 显色时间短 FITC-绿色 TRITC-红色 绿色+红色 ---黄色 双酶双标记 紫蓝色：AKP/NBT 黄色：HRP/AEC 单酶双底物 HRP-DAB：棕色 镍-鈷：黑色 上皮：黑色 淋巴：棕色 增殖细胞（S，G2，M期） 胞核 高压 即用 鼠抗人， 单抗 Ki-67 （增殖细胞核抗原） 上皮细胞 胞膜， 胞浆 胰酶 即用 鼠抗人， 单抗 Cytokeratin（细胞角蛋白） 肌肉组织 胞浆 即用 鼠抗人， 单抗 Desmin （结蛋白） 阳性细胞 阳性定位 预处理 剂型 种属 名称 胞核阳性 * * 二、免疫组织化学 三、免疫荧光组织化学 免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）技术是指在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织呈色反应，借助可见的标记物，对相应的抗原或抗体进行定位、定性和定量检测的一种方法。