用正交设计优化甜菜RAPD反应体系研讨.pdfVIP

2009年 9月 伊犁师范学院学报 (自然科学版) Sept．2o09 第 3期 JoumalofYI¨Norn1aluniverSity(NaturalscienceEditi ) NO．3 用正交设计优化甜菜RAPD反应体系 腊 萍 ，罗淑萍 (1．伊犁师范学院 化学与生物科学学院，新疆 伊宁 835000；2．新疆农业大学 农学院，新疆 乌鲁木齐 830052) 摘 要：采用正交设计对甜菜的RAPD反应体系进行优化．应用Ls(5)正交表，研究了Taq、 Mg、随机引物、dNTPs和DNA模板 5种RAPD反应组分浓度变化对扩增结果的影响，并进行量化 分析，试验结果表明用这种方法建立的甜菜RAPD—PcR优化反应体系为：25 L反应体系中含 1× Buffer、1．0mmol／LMg、1uTaqDNA聚合酶、0．25IIlIl【ol／LdNTPs、O．4“mol／L随机引物及 25ngDNA 模板． 关键词：甜菜；RAPD；反应体系；正交设计 中图分类号：S566-3 文献标识码：A 文章编号：1673—999x (2009)03—0024—07 RAPD(Rand0mAmplifiedPolymol1)hicDNA)，即随机扩增多态性DNA技术，是由美国科学家 lliams 和welsh于1990年分别研究提出的，又称任意引物PcR【¨．RAPD技术是现代分子生物学研究的重要手段之 一 ， 它能在DNA分子水平上反映样 品间的差异．由于用量少，且结果不受采样部位和时间的影响，RAPD 技术 已广泛应用于种质遗传多样性分析、品种鉴定、遗传 图谱构建和分子标记辅助选择等方面 J【~4J．但 RAPD反应结果受诸多因素的影响，如Mg2+、dNTP、模板、TaqDNA聚合酶 (以下简称Taq酶)、所使用的 仪器设备等．因此，必须建立一个稳定又最佳的反应体系来解决这些问题．一般来说，传统的PCR体系优化 方法不仅试验次数多、工作量大以及浪费试剂，而且忽略了PCR反应体系中的各个因子存在动态的交互作 用，最终不一定能获得较佳效果的反应体系．正交设计是用正交表来安排试验 ，用统计学原理来研究各因 子试验的一种设计方法．它所安排的试验具有整齐可比和均衡分散的特点，可以全面了解试验的情况和各 因子之间相互影u向的规律pJ． 本研究将正交设计引入RAPD。PCR条件优化实验中，就影响甜菜RAPD反应的主要因子进行筛选，确 定最佳甜菜RAPD反应条件，为今后从分子水平上研究甜菜的遗传机制建立基础． 1 材料与方法 1．1 DNA 的提取 以甜菜幼叶为材料，参考腊萍等 【】的改 良CTAB法提取核总DNA．用0．7％的琼脂糖凝胶 电泳检测DNA 完整性，并用 LabTechUV-l100紫外分光光度计检测吸光值．根据样品oD260／OD28o分析纯度，用 OD260值 计算样 品DNA浓度 ，稀释至 5n uL、10n uL、l5n uL、20n uL、25n uL备用． 1．2 正交设计方法 选用L25(5。)正交表．各因素及水平见表1，共设25个处理，即25种反应体系．选用新疆．1号DNA作模 板，重复3次．RAPD引物购 自北京奥科生物有限责任公司，分别选用OPNl4、OPB08和OPC18三种引物进 行扩增．T1aq酶、Bu行er、Mg2+、dNTPs、PCR所用超纯水均购 自北京天为时代科技有限公司．各处理反应总 体积均为25uL，每处理均加入2．5 L无M 10×Bu r(终浓度为l×Bu虢r)，然后按照各组分母液浓度 收稿 日期：2o09—0l一22 作者简介：腊萍，女 (回族)，伊犁师范学院化学与生物科学学院助教，硕士． 第3期 腊萍，罗淑萍：用正交设计优化甜菜RAPD反应体系 25 计算其用量，不足体积用超纯水补足，所用M 为25mmol／L． 表 1甜菜 RAPD反应体系的正交设计表及扩增结果 1 lel Theorchog0naldesignforsugarbeetRAPD—PCRsystem andresult0feachtreatment 注：括号中数字表示个水平的取值