分光光度法测定叶绿素含量.pdfVIP

一、实验目的 1.了解植物组织中叶绿素的分布及性质。 2.掌握测定叶绿素含量的原理和方法。 二、实验原理 叶绿素广泛存在于果蔬等绿色植物组织中， 并在植物细胞中与蛋白质结合成叶绿体。 当植物 细胞死亡后，叶绿素即游离出来，游离叶绿素很不稳定，对光、热较敏感；在酸性条件下叶 绿素生成绿褐色的脱镁叶绿素，在稀碱液中可水解成鲜绿色的叶绿酸盐以及叶绿醇和甲醇。 高等植物中叶绿素有两种：叶绿素 a 和 b，两者均易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。 叶绿素的含量测定方法有多种，其中主要有： 1.原子吸收光谱法：通过测定镁元素的含量，进而间接计算叶绿素的含量。 2.分光光度法：利用分光光度计测定叶绿素提取液在最大吸收波长下的吸光值，即可用朗伯 — 比尔定律计算出提取液中各色素的含量。 叶绿素 a 和叶绿素 b 在 645nm 和 663nm 处有最大吸收，且两吸收曲线相交于 652nm 处。 因此测定 提取液在 645nm、663nm 、652nm 波长下的吸光值， 并根据经验公式可分别计算出叶绿素 a、 叶绿素 b 和总叶绿素的含量。 三、仪器、原料和试剂 仪器 分光光度计、 电子顶载天平 (感量 0．01g) 、研钵、 棕色容量瓶、 小漏斗、 定量滤纸、 吸水纸、 擦境纸、滴管。 原料 新鲜 (或烘干 ) 的植物叶片 试剂 1. 96％乙醇 (或 80 ％丙酮 ) 2. 石英砂 3. 碳酸钙粉 四、操作步骤 取新鲜植物叶片 (或其它绿色组织 )或干材料，擦净组织表面污物，去除中脉剪碎。称取剪碎 的新鲜样品 2g ，放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及 3mL95 ％乙醇，研成均浆，再加 乙醇 10mL ，继续研磨至组织变白。静置 3～ 5min 。 取滤纸 1 张置于漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗，滤液流至 100mL 棕色容 量瓶中；用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。 用滴管吸取乙醇， 将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。 直至滤纸和残渣中无绿色为止。 最后用乙醇定容至 100mL ，摇匀。 取叶绿体色素提取液在波长 665nm 、645nm 和 652nm 下测定吸光度，以 95％乙醇为空白 对照。 五、计算 按照实验原理中提供的经验公式，分别计算植物材料中叶绿素 a、b 和总叶绿素的含量 V 叶绿素 a= （12.7 A665 -2.69 A 645 ） × 1000 W V 叶绿素 b= （12.7 A 645 - 2.69 A 665 ） × 1000 W V 总叶绿素 a= （20.0 A 645 + 8.02 A 665 ） × 1000 W A652 V 或总叶绿素 a= 34 .5 1000 W 几种叶绿素含量测定方法比较 叶绿素含量是植物生长过程中一个重要的生理指标 , 由于其对周围环境很敏感 , 并与植物的 光合作用、营养吸收等密切相关 , 被广泛作为植物生长的常规测定指标项目。叶绿素含量的 测定方法有多种 , 在国际上以传统的 Arnon 法 ( 也称研磨法 ) 应用最为广泛。但该法需要把植 物材料研磨并经转移、 过滤或离心处理 , 不仅工作量大 , 而且不可避免地使试验人员较长时间