两株琼胶酶高产细菌的筛选和鉴定.docVIP

EXPRESSLetters 两株琼胶酶高产细菌的筛选和鉴定 杜宗军1王鹏 2 B.Austin * 李筠 P.A.W.Robertson 2 (1青岛海洋大学海洋生命学院266003) (2DepartmentofBiologicalSciences,Heriot2WattUniversity,Edinburgh,Scotland,U.K.) 提要从海洋环境中筛选得到两株琼胶酶的高产菌株,通过形态观察和生理生化反应,确定它们属于弧菌属。通过BIOLOG细菌鉴定系统鉴定,并同弧菌属标准菌株分析比较,确定这两株菌都是塔式弧菌(Vibriotubiashii),这两株菌在碳源利用方面存在差别关键词 琼胶酶,筛选,鉴定,海洋细菌 琼胶(琼脂)由琼脂糖和琼胶酯组成(1→2D2)2L23)2O2β,其中包含有多种取代基如硫酸基、,对于其结构具体细节还不是很清楚。天然琼胶主要存在于某些海藻的细胞壁中,琼胶酶在这些海藻的单细胞分离、酶解破壁制备原生质体等过程中具有重要的使用价值,是一种海藻遗传工程的工具酶[2];同时,琼胶酶在分子生物学方面也多有应用。因此,琼胶酶的研究具有重要的理论意义和应用价值。根据琼胶酶降解琼脂糖的作用方式不同,而把它们分为两类:α2琼胶酶(EC),作用于琼脂糖的α(1→3)糖苷键,产物为琼胶寡糖,以 3,62内醚α22L2半乳糖作为还原性末端;β2琼胶酶(EC1)水解D2半乳糖残基和3,62内醚α22L2 min灭菌后倒平板。 海藻培养基新鲜海藻125g,剪碎,加 入陈海水500ml,氯化钙0.7g,匀浆,4℃曝气过夜, 1.1.2 纱布过滤,补足海水至500ml,加入琼脂5g,121℃, 20min灭菌后倒平板。 1.2.1 细菌斜面采用2216E培养基。取样地点 青岛市黄岛区薛家岛附近 取样及处理方法 海域。 1.2.2 取样分别用无菌离心管取海水、底泥样品处理海水直接稀释涂布平板,底 和海藻。 1.2.3 泥和海藻加入到装有无菌水的试管中,充分振荡,洗涤表面,然后系列稀释,选取合适浓度涂布平板。28℃恒温培养48h。 1.3 半乳糖残基之间的β(1→4)糖苷键,产生的琼胶寡糖 以D2半乳糖残基作为还原性末端。微生物来源的琼胶酶主要来自于细菌,一部分细菌是从河流、土壤和污水中分离得到的,但能够产生琼胶酶的微生物主要来自海洋细菌。由于琼胶被降解,这些细菌的菌落周围会出现凹陷或液化。作者从青岛近海筛选出两株可以高效产生琼胶酶的海洋细菌,并对其进行了鉴定。 筛选和复筛[4] 平板培养48h后,取出观察,具有产生琼胶酶能 力的菌株,菌落周围会出现明显的凹陷。选取凹陷明显的菌株,2216E海洋琼脂平板划线分离纯化。初筛分离纯化得到的菌株,分别接种斜面和平板培养。平板培养72h后用卢戈氏碘液染色观察,琼胶平板可 1.1 材料和方法 培养基 1.1.1 2216E海洋细菌培养基 *达尔文计划资助项目162282065号。 第一作者:杜宗军,出生于1974年,硕士,讲师,从事海洋微 蛋白胨5g, 酵母膏1g,磷酸铁0.1g,琼脂15g,陈海水1000ml 生物学研究。E2mail:duzongjun@ 收稿日期:2001212207;修回日期:2002201221 MarineSciences/Vol.26,No.3/2002 EXPRESSLetters 以被染色,能够产生琼胶酶的细菌,由于菌落周围琼胶被降解,降解后的琼胶不能着色,因此其菌落周围会产生水解圈(透明圈),选取透明圈大的菌株。斜面培养1周,轻微振荡,选取能够液化琼胶斜面的菌株。1.4菌落形态观察 复筛得到的菌株,平板划线28℃培养48h,观察菌落形态。 1.5 2.4利用BIOLOG细菌鉴定系统对两株细菌的鉴定情况 实验结果显示,这两株细菌对于BIOLOGGN平 板上95种碳源可以利用的较少,QM34和QM56都可以利用糊精、糖元、吐温40、吐温80、N2乙酰2D2葡α萄糖胺、纤维二糖、D2果糖、D2半乳糖、2D2葡萄 基本性质测定[1,3] 革兰氏染色、运动性观察、氧化发酵试验、氧化酶 试验、发光实验、葡萄糖产气、鞭毛观察、接触酶试验、 O/129敏感性试验以及需盐性实验按文献方法进行。1.6 利用BIOLOG细菌鉴定系统进行鉴定 1.6.1 BIOLOG 用细菌稀释液蒸馏水500 ml,加入0.01%Phytagel,加热至沸腾,然后加入1.5%NaCl,搅拌,使充分溶解,加入0.03%PF268,搅拌溶解,20ml每管分装,121℃,20min备用。 1.6.2 h中,比色,(透过率52%)。然后接种菌液150μl到96孔板,平板型号为GN2,培养 24h,观察结果。 1.6.3 结果的计算机分析将观察到的结果 输入到计算机,利用Biolog