应用生物技术应用第六部分.pptVIP

为了提高工程菌培养中质粒的稳定性，工程菌的培养一般采用二段培养法， 第一阶段先使菌体生长至一定密度。 第二阶段诱导外源基因的表达。 由于第一阶段外源基因未表达，从而减少了重组菌与质粒丢失菌的比生长速率的差别，增加了质粒的稳定性。在培养基中加入选择性物质如抗生素等，来抑制质粒丢失菌的生长，也是工程菌培养中提高质粒稳定性的常用方法。 六、基因工程药物的质量控制 基因工程药物与传统的一般药品的生产有着许多不同之处，从原料到产品以及制备全过程的每一步都必须严格控制条件和鉴定质量，确保产品符合质量标准、安全有效。 基因工程药物的质量控制主要包括： ①原材料质量控制； ②培养过程的质量控制； ③纯化工艺过程的质量控制； ④产品的质量控制； ⑤产品的保存。 七、基因工程药物制造实例 （一）基因工程菌的组建 干扰素（ＩＦＮ）是人体细胞分泌的一种活性蛋白质，具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节活性，是人体防御系统的组成部分。根据其分子结构和抗原性的差异分为ａ、β、γ、ω等４个类型。早期的干扰素是用病毒诱导人体白血球或白细胞产生的，其产量低、价格昂贵、不能满足需要。现在可以利用基因工程技术并在大肠杆菌中发酵、表达来进行生产。 在干扰素重组ＤＮＡ成功以前，人们对于干扰素的结构一无所知，因而不可能人工合成基因。在人染色体上的干扰素基因拷贝数极少（大约只有1.5％），加工上又有技术困难，所以不能直接分离干扰素基因，而是通过分离干扰素ｍＲＮＡ，再以干扰素ｍＲＮＡ为模板，通过反转录酶等使其形成干扰素ｃＤＮＡ。 干扰素ｃＤＮＡ的获得是将产生干扰素的白细胞的ｍＲＮＡ分级分离，然后将不同部分的ｍＲＮＡ注入蟾蜍的卵母细胞，并测m定合成干扰素抗病毒活性。结构发现１２ｓｍＲＮＡ的活性最高，因而用这部分ｍＲＮＡ合成ｃＤＮＡ克隆到含有lacZ和氨苄青霉素抗性基因的质粒PUC-T之中，转化大肠杆菌Ｋ１２。 将得到几千个重组子克隆中的重组质粒ＤＮＡ放到一个无细胞蛋白合成系统中进行翻译，对每一个翻译体系的产物进行抗病毒的干扰素活性检测。经过多轮筛选获得了产生干扰素的ｃＤＮＡ。最后将干扰素ｃＤＮＡ克隆入大肠杆菌表达载体中，转化大肠杆菌进行高效表达。 （二）基因工程干扰素的制备 （三）质量控制标准和要求 １．半成品鉴定 半成品鉴定，主要包括下列项目： （１）干扰素效价测定：用细胞病变抑制法，以Ｗｉｓｈ、ＶＳＶ病毒为疾病检测系统。测定中必须用国家或国际参考品标准的国际单位。 （２）蛋白质含量测定：用福林－酚法，以中国药品生物制品鉴定所提供的标准蛋白质作标准。 （３）比活性：干扰素效价的国际单位与蛋白质含量的毫克数之比即为比活性。 （４）纯度测定：电泳纯度用非还原型ＳＤＳＰＡＧＥ法，银染显色应为单一区带，经扫描仪测定纯度应在９５％以上。在非还原电泳上允许有少量聚合体存在，但不得超过１０％。用高效液相色谱反相柱或ＧＰＣ柱测纯度，应呈一个吸收峰，其主峰占总面积９５％以上。 （５）相对分子质量测定：用还原型ＳＤＳＰＡＧＥ法，加样量不低于５μｇ。同时用已知相对分子质量的蛋白标准系列作对照，以迁移率为横坐标，相对分子质量的对数为纵坐标作图，计算相对分子质量，再与干扰素理论值比较，其误差不得高于１０％。 （６）残余外源ＤＮＡ含量测定：用放射性核素或生物素探针法测定，每剂量针残余外源性ＤＮＡ应低于１００ｐｇ。 （７）残余血清ＩｇＧ含量测定：在应用抗体亲和层析法作为纯化方法时必须进行此项鉴定。例如，用鼠杂交瘤单克隆抗体时应测定鼠ＩｇＧ含量，可用酶标或其他敏感方法测定，每剂量（20μｇ）的鼠IgG的含量应在100ｎｇ以下。 （８）残余抗生素活测定：凡菌种传代中曾经使用过抗生素者，均应测定相应抗生素活性，半成品中不应有残余抗生素活性存在。 （９）紫外光谱扫描：检查半成品的光谱吸收值，用全自动紫外分光光度计观察紫外光范围内光谱图，最大吸收值应为２８０ｎｍ±２ｎｍ。 （１０）肽图测定：用ＣＮＢｒ裂解法，测定结果应符合该干扰素的结构，且不同批次之间肽图应一致。此外还应作等电点测定：用等电点聚焦电泳法测定，批与批之间等电点应完全相同。而且除菌半成品应作干扰素效价测定、无菌实验、热源质试验。 ２．成品鉴定 产品鉴定，主要包括下列项目： （１）物理性状：冻干制品外观应为白色或微黄色疏松体，加入注射水后，不得含有肉眼可见的不溶物。 （２）鉴别试验：应用ＥＬＩＳＡ或中和试验鉴定。 （３）水分测定：用卡氏法，水分含量应低于３％。 （４）无菌试验：同半成品鉴定。 （５）热源质试验：同半成品鉴定。 （６）干扰素效价测定：同半成品鉴定，效价不低于标示量。 （７）安全试验：取体重350～400ｇ豚鼠３只，每只腹侧皮下注射剂量为人每千克体重临床使用量最大量的３倍，观察７ｄ，若豚鼠局部无红肿、坏死、总体重不下降