兔肝匀浆样品体积.docVIP

谷胱甘肽转硫酶的制备及动力学研究 冯清华周二 【摘要】 谷胱甘肽转硫酶(glutathione S‐transferase, 简称GST，EC2.5.1.18)广泛存在于动物和人体的各种组织中，通过催化芳香环氧化物、过氧化物和卤化物与还原型谷胱甘肽(GSH)反应，增加产物的水溶性，参与机体的解毒过程。本实验利用GST与GSH之间的这种特异性作用，运用亲和层析从兔肝中提取纯化GST。继而通过蛋白含量以及酶活力的测定，计算GST的比活力，进行相关的动力学研究。 【关键词】 GST 酶动力学 亲和层析 米氏方程 考马斯亮蓝G-250法 【引言】 GST是机体内广泛参与芳香环氧化物、过氧化物和卤化物的解毒作用的重要的同工酶家族。本实验首先将对酶进行分离纯化，方法是采用亲和层析从兔肝提取液中纯化得到GST，亲和层析中使用的配基为GST的底物GSH。以含有金属螯合剂、还原剂等的平衡缓冲液BufferA 除去杂蛋白，一方面有强的离子洗脱强度，一方面又能保持目的蛋白的活性；继而使用含有GSH的BufferB洗脱GST目的蛋白。 在酶动力学研究中，采用1‐氯‐2,4‐二硝基苯(CDNB)和还原型谷胱甘肽(GSH)作为酶的底物，以分光光度法记录酶促反应生成产物GS‐DNB 引起的光吸收增加值，在338nm处连续测定反应过程中产物吸光值变化，可作出A338nm -t曲线，计算酶活力。 如上利用反应，在酶和底物反应达到预定的1min时，立即加入强酸终止酶促反应。测定光吸收增加值，计算这段时间内反应的平均速度并近似替代反应初速度，通过作图法求出米氏方程的两个参数Km 和V。 最后用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量，利用其在酸性溶液中自然呈现棕红色，而与蛋白质疏水结合后变为蓝色，最大吸光值从465nm移到595nm处的原理，可通过测量其在595nm处的吸光度增量，即可测定蛋白质含量。再根据酶活力和蛋白质含量求出匀浆液与酶液的比活力，通过计算总活力的回收率、比活力的提高倍数，评价GST 的提纯效果，进行酶动力学问题的相关探讨。 材料与方法 1.1试剂与材料 1.1.1 实验试剂 1.1.1.1 亲和层析： Buffer A：0.025mol/L 磷酸盐缓冲液，pH7.4，含3mmol/L DTT，1mmol/L EDTA，0.2mol/L NaCl；Buffer B: 0.025mol/L 磷酸盐缓冲液，pH7.4，含3mmol/L GSH，2mmol/L DTT 1.1.1.2 酶活力测定： 60mmol/L GSH (重蒸水溶解)；0.1mol/L PB (pH 6.5)200ml；50% TCA；60mmol/L CDNB 1.1.1.3 蛋白质含量测定： 500μg/mL 标准蛋白溶液； 考马斯亮蓝G-250溶液10ml 1.1.2 实验材料 兔肝匀浆液，Sepharose 4B-GSH 1.2实验仪器 1.5cmX10cm层析柱，核酸-蛋白紫外检测仪，可见分光光度计，移液枪，注射器，秒表，紫外分光光度计，便携式记录仪，比色杯 1.3实验步骤 1.3.1亲和层析法纯化谷胱甘肽转硫酶 1.3.1.1 准备层析柱： 垂直柱体，放入大漏斗，保持凝胶上洗脱溶液体积与凝胶体积比为2：1，搅拌中将凝胶均匀连续倒入柱体，沉降2～3min后，开下出口，滴速5～6s/滴；至柱床高2～3cm时，停止装柱。连接蛋白检测系统，用Buffer A平衡（约10-20mL），至记录仪基线平稳。 1.3.1.2 样品制备： 取4g兔肝，剪碎，加入约10倍组织重的Buffer A，用组织捣碎机匀浆；匀浆液先用10000r/min离心10min，弃沉淀，上清再次离心（4°C，100000r/min，40min），弃沉淀，滤纸过滤上清液，称量体积。 1.3.1.3 亲和层析分离GST: 将滤液上柱，流速约3—4秒1滴，透过峰量体积。用Buffer A洗去杂蛋白至柱中介质变白，记录仪回到基线。用Buffer B洗脱，流速约3—4秒1滴，收集洗脱峰（约5mL），混匀并量体积，分装成两管冷冻。 1.3.2 测定GST酶活力、米氏常数和最大反应速度 1.3.2.1 测定酶活力： 调整紫外分光光度计的参数：Wavelength:338nm，Delay Time:30s，Cycles:8。 样品1：兔肝匀浆液；样品2：上样透过液；样品3：洗脱峰（酶液） 调节加入样品的量使得ΔA338nm/min 在0.2‐0.5 之间。实验中按下表1.1 加样操作。 空白 样品1 样品2 样品3 0.1mol/L PB(pH6.5)/mL 2.9 2.9 2.9 2.9 60mmol/L CDNB/μL 50 50 50 50 60mmol/L GSH/μL 50 50 50 50 将空白