流式细胞仪原理及应用、CD4绝对计数的原理、方法和质量控制.ppt

设定分析群体 CD3 CD4 * ppt课件 CD3 CD8 CD8 管分析 * ppt课件 绝对计数公式 CD4 细胞数 内参微球数 X # 获取微球数 mL 全血体积 = CD4 细胞 mL 全血 * ppt课件 举例 # 2 # 1 X # 获取微球数 mL 全血 = CD4 细胞 mL 全血 CD3 CD4 绝对计数计算 * ppt课件 CD4 质控微球 绝对计数计算 * ppt课件 CD4+T细胞检测的质量控制 质量控制 是指在每一次实验过程中为确保实验工作正常进行而必须采取的各种措施。 * ppt课件 实验前质量控制 　　①采集标本前病人的准备； 　　②正确的标本采集方法； 　　③准确及时的运送标本； 　　④实验前正确地处理和保存标本。 实验中质量控制 　　①质控品的准备； 　　②试剂的评价选择 ③ 仪器的校准 　　 ④开展Levey-Jennings 质控图质控（或“即刻法”质控）。　 实验后质量控制 　　①实验后准确填写检验结果； 　　②及时发出报告； 　　③正确地解释检验结果的临床意义　 ④文件管理 * ppt课件 实验前质量控制 特别注意 运输温度：室温 运输时间： 双平台6小时，单平台24小时 样品处理：专人，及时， 规范。 * ppt课件 实验中质量控制 质控品： 质量和价格，长期使用 试剂选择： 不推荐混用不同厂家的试剂 仪器校准： 厂家定期， 实验室 质控图： 每天要做 * ppt课件 二色镜 1 2 3 带通滤波片 光电倍增管 激光束 细胞 收集透镜 前向散射光 侧向散射光，荧光 光信号分离，导向，各探测通道PMT接收并转化为电信号。 2、光学系统：激光光源、分色反光镜、光束成形器、透镜组、滤片、光电倍增管 * ppt课件 数据处理系统 FSC SSC FL1 FL2 FL3 对数 线性 线性 线性 对数 脉冲处理，模数转换 光信号 电信号 记录数据，显示结果 （面积，峰高，宽度） * ppt课件 基本工作原理 * ppt课件 非荧光信号 颗粒度 细胞大小 散射光的测定 * ppt课件 散射光信号区分裂解后的外周血细胞群 * ppt课件 荧光测量 荧光染料被激发而发射的光信号 多荧光标记胞内多种组分，实现多参数测量 线性放大：信号强度变化范围较少、生物学线性过程 对数放大：信号强度变化范围较大、光谱信号复杂 * ppt课件 自发荧光 特异荧光 特异荧光 * ppt课件 数据的显示与分析 参数 FS SS FL * ppt课件 单参数直方图 一维参数（荧光或散射光）与颗粒技术（Count）构成，反映同样荧光强度的颗粒数量的多少 横坐标：光信号波长相对值（信道） 纵坐标：被测细胞的相对数量 数据显示方式 * ppt课件 双参数直方图 点图 二维等高图：等高线连接相同细胞数的点 密度图 假三维等高图 * ppt课件 三参数直方图 * ppt课件 流式细胞仪的多参数分析 Region设置 指在同一张单参数或双参数直方图上根据信号的强弱划定分析区域，从而计算分析区域内的细胞数量。 CD45 FITC (log) CD14 PE (log) * ppt课件 G2 Gate设置 是指在某一张选定参数的直方图上根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。 * ppt课件 双平台法： 单平台法： 流式细胞技术检测CD4+T细胞 * ppt课件 流式细胞技术 传统的FCM: 双平台法 需要两台仪器 需要几个制备和分析步骤 分析能力低 结果受多个因素影响 昂贵 * ppt课件 传统的FCM: 单平台法 只需一台仪器 较少的制备和分析步骤 非常昂贵 * ppt课件 美国CDC 推荐 (2003) 单平台测定CD4+ T 细胞绝对数指南 - FDA 批准的商业荧光微球计数试剂 以 CD45 设门 三或四色流式细胞仪 三色组合 1) CD3/CD4/CD45 2) CD3/CD8/CD45 3) CD3/CD19/CD45 四色组合 1) CD45/CD3/CD4/CD8 2) CD45/CD3/CD19/CD16 和/或 CD56 * ppt课件 FACSCaliburTM 系统 选配 BDB Tritest/TruCOUNTTM 试管 *