食品免疫学免疫检测技术与食品安全检测.pdfVIP

西北农林科技大学食品学院免疫学课件 第八章 免疫学技术 第八章 免疫学技术 第一节 抗原抗体的制备 一、抗原的制备 制备特异性的抗原是制的合格抗体的前提条件， 而作为检测诊断的抗原也必须是纯化的 抗原。抗原的物质很多，很少是单一成分，必须从复杂的组分中提取分离。 按抗原的物理状态，可分为天然抗原、人工抗原和合成抗原三类。 1、天然抗原的制备 （1）颗粒性天然抗原 常见的颗粒抗原包括动物、植物、微生物的细胞，和有关的细胞组成结构，如细胞的细 胞壁、线粒体，细菌的鞭毛和菌毛等。 一般步骤为：首先收集抗原细胞或（和）扩增培养，然后离心或过滤收集细胞或细胞组 成结构物，再进行病原微生物灭活。 （2 ）可溶性抗原的分离纯化 蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶、补体、细菌毒素、免疫球蛋白片段、核酸等皆为良好的 可溶性抗原，免疫前常需纯化。 细胞破碎方法有：冻融法；超声破碎；高速组织捣碎机法；研磨法；溶菌酶、蜗牛酶、 纤维素酶处理 可溶性蛋白抗原的分离方法： 离心分离法：差速离心、密度梯度离心 选择沉淀法：盐析沉淀法；有机溶剂沉淀法，常采用乙醇或丙酮 核酸去除法， DNA 酶、 RNA 酶处理； 水溶性非离子型聚合物沉淀法：常用非离子型聚合物为分子量为 2000～6000 的聚乙二醇 （PEG ） 凝胶过滤法 ：又称分子筛层析。通过凝胶分子筛作用，可将大、中、小三类分子分开， 选择凝胶柱时应注意选用适于分离范围内的凝胶。 离子交换层析法： 离子交换层析是利用一些带电离子基团的凝胶或纤维素吸附带有相反 电荷的蛋白质抗原。 亲和层析法： 亲和层析是利用生物分子间所具有的专一性亲和力而设计的层析技术。 如 抗原和抗体、 酶和酶抑制物、 酶蛋白和辅酶、 激素和受体、 DNA 和 RNA 等之间有特殊亲和 力，一定条件下，两者可紧密结合成复合物， 如将复合物的一方固定于固相载体上，则可从 溶液中分离和提纯另一方。 纯化抗原的鉴定 主要对纯化抗原的含量、理化性质、纯度及免疫活性进行鉴定，常用方法有酚试剂法、 聚丙烯酰胺凝胶电泳法、免疫电泳法、免疫双扩散法等。 2、人工抗原的制备 人工抗原指经过人工修饰的半抗原，即将半抗原与载体连接后形成的完全抗原。 小分子半抗原可以是多糖、多肽、核酸、类固醇激素、某些药物及其它化学物品。 在食品检验中常见的小分子半抗原有各种农药、 兽药、 添加剂与非法添加物 （盐酸克伦 特罗）、真菌毒素等等。 常用载体：蛋白质、多肽聚合物、大分子聚合物。 1 西北农林科技大学食品学院免疫学课件 第八章 免疫学技术 蛋白质：常用牛血清白蛋白（ bovine serum albumin,BSA ）、卵清白蛋白（ OVA ）、人血 清白蛋白（ HSA ）、兔血清白蛋白（ RSA) 。 多肽聚合物：常用多聚赖氨酸。 大分子聚合物：聚乙烯吡咯烷酮（ PVP ）、羧甲基纤维素 (CMC) 等皆可与半抗原结合， 加入弗氏佐剂课产生良好的抗体。 连接方法： 物理法 是用物理吸附法将载体与半抗原连接， 其原理是通过电荷和微孔来吸半抗原， 吸附载体主要有 PVP 和 CMC 等； 化学法 是利用某些功能基团把半抗原连接到蛋白质类或多肽类聚合物载体上。不同 的半抗原应选用不同的方法进行连接。 根据半抗原拥有的化学基团不同，连接方法主要有以下几类： ①带游离氨基或羧基以及二种基团皆有的半抗原：