逆转录病毒载体及其在动物病毒病研究中的应用.docVIP

逆转录病毒载体及其在动物病毒病研究中的应用 摘要 逆转录病毒表达系统是一种新的重组蛋白高效表达系统，由逆转录病毒载体，包膜蛋白载体和包装细胞系组成。逆转录病毒载体具有基因组结构简单，便于基因操作、转染效率高、容量较大、宿主范围广、易于分离等优点，在外源基因表达、基因治疗、转基因、生物制药等方面应用广泛。本文就逆转录病毒表达系统的分子生物学特性、组成、构建流程及其在动物病毒病研究中的应用进行综述。 目前RNAi技术已被广泛应用于生命科学研究的各个领域，在病毒学尤其是动物病毒学研究中取得了重大进展，被认为是非常有效的抗病毒方法。在细胞或组织中诱导RNAi的方法很多，采用siRNA表达载体或使用短发夹RNA（shRNA）表达框导入细胞，表达加工成内源性siRNA。病毒传递系统包括逆转录病毒载体[1]、腺病毒载体、疱疹病毒载体等，可以将RNAi应用到细胞、组织和活体动物中，使其应用的范围更加广泛。逆转录病毒载体是最早成功应用于临床基因治疗的载体，它具有将目的基因高效转染细胞并稳定表达的优点[2]。本文就逆转录病毒载体的分子生物学特性及其在动物病毒病研究中的应用进行综述。 1逆转录病毒的分子生物学特性 早期的逆转录病毒(retrovirus vectors，RV）)大多基于禽类病毒衍生而来，现在主要以Moloney小鼠白血病病毒(一种肿瘤反转录病毒)为基本骨架构建形成。它能感染多种不同种类生物的细胞；感染效率高，对最适细胞的感染率可以达到100％。 RV基因组约10kb左右，编码区含有4个结构基因，从5′至3′依次为gag-pro-pol-env。病毒核心蛋白（Gag）是病毒粒子的非糖结构蛋白，这些蛋白质的氨基酸序列在同属内的病毒之间比较保守，具有相似的抗原性，为群抗原。酶蛋白（Pro）：反转录病毒粒子中的酶蛋白有蛋白酶（PR）、反转录酶（RT）、整合酶（IN）等三种。有些病毒的蛋白酶来自一个独立的前体蛋白，如禽白细胞增生症病毒（ALV）；有些来自Gag-Pol蛋白前体，如鼠白血病病毒（MLV）；有些来自Pro-Pol蛋白前体，如人免疫缺陷病毒（HIV）。反转录病毒pol基因的初始产物为一个大的蛋白前体，经蛋白酶作用后氨基端形成反转录酶，羧基端形成整合酶。核衣壳蛋白（Env）：反转录病毒的囊膜蛋白为糖蛋白，蛋白质部分有两条肽链组成，较小的那条链贯穿病毒的囊膜，称为穿膜蛋白（TM），较大的那条链通过二硫键和氢键与TM相连，暴露于囊膜之外，称为表面蛋白（SU）。二者均来自env基因编码的前体蛋白，经水解后产生。逆转录基因转移表达系统中，gag和pol基因内源化入包装细胞GP2-293中，包装细胞稳定表达这两个基因。由于子代病毒包装所需要的基因分配到不同的质粒载体中，因此在可插入外源基因的质粒中，两个长末端重复序列（LTR）之间可插入的外源基因的长度可以增大，提高了其应用价值。 逆转录病毒基因组复制最显著的特点就是从RNA到DNA的反转录过程。病毒RNA进入细胞后，DNA即在胞浆内合成。反转录过程结束后，生成线状双链DNA两端的重复区比病毒基因组RNA的重复区长，故称为长末端重复序列（LTR）。3′端和5′端的LTR结构相同，均由来源于RNA基因组3′端的U3区、来源于5’端的R区组成。新生成的病毒DNA与宿主细胞染色体DNA结合，随机整合成为染色体的一部分，随染色体的复制而复制，借助宿主细胞RNA聚合酶Ⅱ，转录产生病毒RNA，指导蛋白质的合成。 2逆转录病毒载体的组成 逆转录病毒表达系统通常由包膜蛋白载体，用外源基因替换病毒结构基因的逆转录病毒载体和基因组DNA中整合了逆转录病毒结构基因的包装细胞系组成。三者功能互补，产生具有感染力的假型病毒颗粒，将含有假病毒颗粒的包装细胞培养上清感染相应的靶细胞，实现目的基因与靶细胞染色体DNA整合。 用于表达外源基因的典型的逆转录病毒载体如图1（a）所示，其基本结构和特点为：（1）5′ LTR为CMV／MSV杂合启动子，缺失一段序列的3 ′LTR作为终止子，不会在体内发生重组；（2）保留包装信号(?＋)序列；（3）去除了野生型病毒的结构基因，保证载体使用的安全性；（4）在目的基因后用内部核糖体进入位点连接抗性基因，可以根据需要选择不同的抗性。其优点是稳定整合入宿主细胞能持久表达目的基因，感染细胞范围广，基因容量较大( 8kb)，机体对载体产生的免疫反应较低。缺点是载体的整合是随机的，靶基因表达受插入位点两侧的宿主DNA序列影响，并可导致插入突变，而且MLV整合前复合体从胞浆迁移到胞核需依赖于有丝分裂过程中核膜的破裂，所以载体只感染分裂细胞。Parveen等[3]用点突变法在病毒的基质蛋白基因中引入一个核定位信号序列后，病毒能穿透靶细胞核，也可用于转染不分裂细胞。采用水泡性口炎病毒糖蛋白载体(pVSV-