植物体内游离脯氨酸的含量测定 .pptVIP

植物体内游离脯氨酸的含量测定 一、实验目的 学习掌握脯氨酸含量的测定方法，了解逆境条件下，脯氨酸含量的变化情况，认识脯氨酸是一种逆境生理指标 二、实验原理 采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减小了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态（干或鲜样）限制。在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后，此缩合物在波长520nm处有一最大吸收峰。脯氨酸浓度的高低在一定范围内与其消光度成正比。 三、材料、仪器设备及试剂 1. 材料：受环境胁迫的植物叶片（高温及常 温处理的小麦叶片）。 2. 仪器设备： 分光光度计；水浴锅；漏斗；试管数支；滴管。 二、材料、仪器设备及试剂 3. 试剂： 3%磺基水杨酸水溶液；甲苯； 2.5%酸性茚三酮显色液：冰乙酸和6mol/L 磷酸以3︰2混合，作为溶剂进行配制，此液在4℃下2～3日有效； 脯氨酸标准溶液：称取25mg脯氨酸，蒸馏水溶解后定容至250ml，其浓度为100μg/ml。再取此液10ml用蒸馏水稀释至100ml，即成10μg/ml的脯氨酸标准液。 四、操作步骤 1．标准曲线制作 （1）取7支具塞刻度试管按下表加入各试剂。混匀后加玻璃球塞，在沸水中加热40min。 四、操作步骤 （2）取出冷却后向各管加入5ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层以“0”管为对照在波长520nm下比色。 （3）以消光值为纵坐标，脯氨酸含量为横坐标，绘制标准曲线，求线性回归方程。 四、操作步骤 2．样品测定 （1）脯氨酸提取 取高温和常温处理的小麦叶片0.5g左右，分别置于两支试管中，各加入5ml 3%磺基水杨酸溶液，于沸水浴中浸提10min。（注意叶片叶片需浸没在提取液里，可用玻棒搅动） （2）取出试管待冷却至室温后，吸取上清液2ml，加2ml冰乙酸和2ml茚三酮显色液，于沸水浴中加热30min，冷却后加4mL甲苯，剧烈摇动30s，进行萃取，取上层脯氨酸红色溶液于520nm处比色。（用甲苯做空白调零） 五、实验报告 结果计算： 回归方程： pro(μg)=41.873A520 – 0.0094 单位鲜重样品的脯氨酸含量： 六、注意事项 1. 叶片需完全浸入提取液，以使提取完全 2. 比色操作的规范，以免皮肤着色 3. 甲苯与水不混容，比色皿不可见水，可用甲苯或酒精润洗比色皿 4. 甲苯用后，比色皿中的溶液需回收。 * ×100% 5χ/2 样品鲜重×106 比较不同处理下样品中脯氨酸含量的变化，并加以解释 * * *